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枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的第一个基因工程表达菌,由于其无内毒素,且遗传背景清楚而被公认为最优良的表达宿主之一。然而枯草芽孢杆菌作为产品生产菌也暴露出一些问题:胞外蛋白酶比较多,且分泌的目标蛋白常常容易被降解;质粒不稳定性;不能正常分泌真核来源的蛋白等。许多研究者对枯草芽孢杆菌168进行了改造,如利用缺失突变使染色体上相应的胞外蛋白酶基因失活,构建一个或多个蛋白酶失活的突变体,如WB600和WB700。当目标蛋白在这些突变体中表达时,其产率和稳定性有所提高。即便如此,残存的酶活性也能降解高敏感的外源蛋白。
本实验从加速蛋白折叠,提高前体蛋白的转运效率以及防止蛋白在转运过程中被降解的角度分析,进一步提高目标蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达量:采用在枯草芽孢杆菌中表达一些具有分子伴侣功能的外源蛋白或者是提高枯草芽孢杆菌自身分子伴侣蛋白的表达剂量来提高目标蛋白的分泌水平。
将csaA(来源于枯草芽孢杆菌),groes.operon(来源于地衣芽孢杆菌ATCC14580),prsA(来源于地衣芽孢杆菌ATCC14580)三种分子伴侣基因分别整合到枯草芽孢杆菌168基因组中,检测遗传背景发生改造的菌株对来源于巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶.PGA)表达的影响。结果显示,将groes.operon,prsA整合进枯草芽孢杆菌基因组得到的背景菌株与对照菌株相比PGA的表达量没有明显变化。整合了csaA后的菌株与对照菌株相比,PGA表达量提高约46%。本研究为CsaA是枯草芽孢杆菌细胞内的分子伴侣这个推论提供了佐证,也对分析PGA的分泌途径以及CsaA的生物学功能提供了参考。
将巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶.PGA)编码基因整合进枯草芽孢杆菌的基因组,得到了可以使PGA稳定表达的枯草芽孢杆菌菌株,缓解了枯草芽孢杆菌中质粒表达不稳定的缺点。本实验分别构建了三种不同PGA拷贝数的枯草芽孢杆菌菌株,同时还分析了不同拷贝数的PGA在枯草芽孢杆菌中表达量的差异。试管培养36h时,菌株B.subtilis/xhoI-,aprE-,vprE-的酶活力为3U/L,菌株B.subtilis/xhol::pga为.U/L,菌株B.subtilis/xhol::pga,aprE::pga为1.U/L,菌株B.subtilis/xhol::pga,aprE::pga,vprE::pga为2.U/L。得出整合的拷贝数越多,PGA的表达量越高。