目的:为进一步了解恶性疟原虫A型RIFIN的基因多态性和体液免疫特性,本研究观察分析与重症恶性疟以及免疫逃避相关的A型rif基因的选择和宿主的差异关系;鉴定野生型、突变型A-RIFIN多肽与宿主体液免疫（IgG）的反应情况;初步探索A-RIFIN多肽与抑制性受体LILRB1结合的关键片段及结合的关键位点,为研究恶性疟原虫A-RIFIN的分子和免疫学功能提供数据依据。方法:首先,对加纳输入中国的恶性疟病例的全血样本经提取基因DNA后进行PCR确认样本是否为单一恶性疟原虫感染,将符合要求的样本用Covaris S2仪将样本基因组DNA打碎成500bp的小片段,构建文库,用Illumina X-10测序仪对所有文库进行全基因组重测序,同时从PlasmoDB中下载恶性疟原虫3D7的参考序列,从pf3k中下载2013年的92个加纳本地恶性疟原虫样本全基因组的单核苷酸多样性（single nucleotide polymorphism,SNP）数据,构建参考数据集。将质量评估较好的样本用数据分析技术根据测序结果计算其PCA、STRUCTURE等进行遗传结构的分析,并分别计算不同群体的核苷酸多态性（π）及两个种群间的群体遗传差异（FST）,计算Tajima’s D、FST、iHS、XP-EHH统计值分析恶性疟原虫全基因组受自然选择情况,鉴定出其中受强选择的基因,并观察在此样本中A型rif基因在两个人群中受选择情况的区别,判断A型rif的选择与宿主差异的关系。将病例样本的全基因组数据组合后,筛选出几种A型rif的编码序列信息,参考目的基因序列（3D7）,合并数据后用MEGA6软件、DNAsp软件进行单基因多态性分析,找出野生型和突变型A-RIFIN序列,合成多肽,通过间接ELISA法检测多肽与恶性疟病人全血的体液免疫反应（IgG）,再将野生型和突变型A-RIFIN多肽免疫新西兰兔,通过ELISA实验分析野生型和突变型A-RIFIN多肽的免疫原性和免疫反应性差异。运用ELISA方法研究野生型和突变型A-RIFIN多肽与抑制性受体LILRB1的分子互作,根据反应结果设计单一位点基因突变的突变型多肽,再次实验观察其与抑制性受体的结合情况,判断A-RIFIN多肽和LILRB1抑制性受体结合的关键位点。结果:通过分子检测和评估,共筛选出9个由加纳输入中国的恶性疟单一感染病例样本进行全基因组测序、分析。用PCA对两个种群的多样性差异进行分析,结果显示在种群结构中恶性疟原虫样本一般按地理来源聚类,且加纳输入中国的样本可视为加纳本地种群的一部分。加纳输入中国和加纳本地样本的π均值分别为0.0013和0.0017,与加纳本地样本的参考序列相比有较低的遗传多样性,但在红细胞入侵和免疫相关的基因方面,加纳输入中国样本的遗传多样性高于加纳本地样本,如rif（0.0116）、var（0.012）和stevor（0.013）。FsT均值为0.13,只有少数VSAs基因（54个rif,7个stevor,没有var）为高FST值,rif家族的两个亚组在FST检验中表现出显著性差异（P=0.038,z检验）。在基因自然选择上,加纳输入中国的样本和加纳本地样本的Tajima’s D平均值分别为-0.66和-1.58,加纳输入中国的样本显著高于加纳本地样本（P<0.0001,配对z检验）,而在受强选择的基因差异方面,VSAs基因家族的Tajima’s D值在两个不同地区样本中的差异非常小,没有表现出强选择性。但从XP-EHH的检验结果可知两个样本的VSAs家族中都有部分基因显示出强选择性,不过这些选择特征是分散在不同的单个基因中,例如通过iHS统计,在输入性样本中,我们发现前1%的强选择SNP涉及329个基因,包括66个rif、46个var、5个msp和12个stevor。通过全基因组结果和本课题组之前的研究分析A-RIFIN突变位点,合成多肽,具体分别是从PF3D71254800序列中挑选出从234到254位置的三条多肽,即野生型1-RIFIN 和突变型 2-RIFIN、3-RIFIN,从 PF3D71100400 序列中挑选出从 252 到 272位置的两条多肽,即野生型4-RIFIN和突变型5-RIFIN,从PF3D70900200序列中挑选出从182到205位置的两条多肽,即野生型6-RIFIN和突变型7-RIFIN,以及从243到267位置的两条多肽,即野生型8-RIFIN和突变型9-RIFIN。在这9条多肽中,4-RIFIN、5-RIFIN、8-RIFIN、9-RIFIN的实验结果表明这四条多肽在与恶性疟病人和正常人血液样本的反应中有显著差异性（P值分别为0.0010、0.0076、<0.0001、0.0006）,在同型多肽的野生型和突变型之间只有野生型8-RIFIN与突变型9-RIFIN与恶性疟病人全血IgG反应有显著差异性（P<0.0001）。在与相应兔多抗的反应中,野生型8-RIFIN与突变型9-RIFIN都有较好的免疫原性和免疫反应性,但野生型8-RIFIN多肽与突变型9-RIFIN免疫的兔多抗反应较弱。在与宿主抑制性受体LILRB1的分子互作研究中显示,在9个多肽中,只有A-RIFIN蛋白PF3D70900200的野生型多肽8-RIFIN与LILRB1受体有结合反应,而其突变型多肽9-RIFIN以及单一位点突变型多肽10-RIFIN均与LILRB1受体不反应。结论:通过对加纳输入中国以及加纳本地恶性疟原虫样本全基因组测序分析发现,在恶性疟原虫来自同一个国家的背景下,A型rf基因在这两个不同种群中存在明显的选择差异,并且认为该差异的来源主要是宿主免疫或地区传播水平的不同。对A型rif基因等VSAs家族的选择是分散在不同的单个基因中。根据FST检验结果可知很多A型rif基因的FST值达到0.25以上,说明该基因家族在加纳输入中国和加纳本地样本间呈现出很大的遗传分化;根据对A型rif单基因分析结果及结合前期的研究,本研究在PF3D71254800、PF3D71100400和PF3D70900200这三个基因对应的A-RIFIN中筛选合成了4条野生型多肽和5条突变型多肽,通过与恶性疟病人血液样本的免疫反应性实验结果提示A-RIFIN蛋白的编码基因多态性对宿主的体液免疫（IgG）应答水平有影响,其中从PF3D70900200中挑选的野生型多肽（8-RIFIN）与突变型（9-RIFIN）免疫反应性差异较显著（P<0.0001）。结合野生型多肽（8-RIFIN）与突变型多肽（9-RIFIN）的免疫多抗交叉结合反应提示PF3D70900200中243到267位置突变会引起宿主疫反应水平下降。在与宿主抑制性受体LILRB1 的分子互作研究发现,A-RIFIN蛋白PF3D70900200的野生型多肽8-RIFIN与LILRB1受体有较强的结合能力,突变会影响与抑制性受体的结合,而且通过多肽序列比对发现该多肽Y243到G267位置与已有的A-RIFIN（PF3D71254800）-LILRB1复合体的晶体结构关键作用片段一致,同时确定了该蛋白中此多肽与抑制性受体LILRB1结合的关键性位点F264R。本研究从基因多态性、免疫特性以及分子互作等多个层面探索了 A-RIFIN蛋白参与机体免疫应答及调控的初步机制,发现A型rif基因在不同宿主人群中具有显著差异性,并且基因突变影响了 A型RIFIN多肽的免疫反应性和结合LILRB1抑制性受体的能力,为进一步开展A型RIFIN蛋白的分子和免疫学功能研究提供了基础。