绿僵菌素(destruxins，dtx)是金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae等虫生真菌在代谢过程中产生的一种重要的环缩肽类次生代谢产物，是绿僵菌的主要毒力因子。绿僵菌素可作用于昆虫的血淋巴免疫系统，对昆虫血细胞有毒，可以抑制昆虫抗菌肽的分泌能力。为了进一步研究绿僵菌素作用于昆虫血淋巴系统的机理，本文以鳞翅目模式昆虫--家蚕Bombyx mori Linneus为研究对象，通过细胞生物学技术研究了绿僵菌素对昆虫血细胞的毒性及对血细胞形态的影响；用蛋白质双向电泳技术对绿僵菌素作用于昆虫血淋巴后的差异蛋白进行了筛选，并通过质谱技术对差异蛋白进行了分析鉴定。主要研究结果如下：　　1、绿僵菌素对家蚕血细胞形态的影响　　通过倒置相差显微镜观察发现，昆虫血细胞经不同浓度的绿僵菌素A处理后，处理组的血细胞形态较对照组发生了明显的变化。随着处理时间的延长和绿僵菌素A浓度的升高，血细胞出现细胞膜收缩、向内凹陷，细胞质外泄，细胞核偏移，细胞内形成空泡，细胞表面有瘤状凸起，细胞聚集成团的现象越明显。浓度为50μg/mL的绿僵菌素A处理6 h后，细胞表面线状伪足的数目显著增加，并向细胞四周延伸形成辐射状，而随着绿僵菌素A浓度升高，线状伪足数目减少，200μg/mL时已观察不到线状伪足。随着处理时间的延长和绿僵菌素A浓度的升高，聚集成团的细胞数目越多，且伴随有大量的血细胞破碎死亡，细胞边缘界限模糊不清，视野中可见的细胞碎片也越来越多，几乎找不到完整的血细胞。　　通过荧光显微镜观察发现，不同浓度的绿僵菌素A处理24 h后，处理组与对照组相比，血细胞形态特征发生了明显的变化，处理组细胞死亡数目明显多于对照，且随着绿僵菌素A浓度的升高，血细胞聚集、细胞质外泄、细胞破裂死亡的数目越多，在荧光显微镜下发出橙红色荧光的细胞数目也越多，荧光强度也越强，说明血细胞的死亡数目与绿僵菌素A的浓度呈现出线性关系。　　绿僵菌素A处理24 h后，经PI染色，在荧光显微镜下观察，浆血细胞和粒血细胞都出现了死亡现象，在绿僵菌素浓度相同的条件下，粒血细胞比浆血细胞的死亡率更高，说明粒血细胞比浆血细胞对绿僵菌素A更加敏感，绿僵菌素A对浆血细胞和粒血细胞的LC50分别为84.11μg/mL和68.77μg/mL。　　在环境扫描电镜下观察发现，经绿僵菌素A处理后的血细胞细胞膜出现皱缩或者细胞表面变得光滑，细胞表面的微绒毛减少，线状伪足数目减少或消失，细胞表面出现了明显的凹陷，严重的甚至导致细胞膜穿孔。细胞表面形成了明显的瘤状凸起，有的凸起已经形成小泡，脱离或通过细胞膜之间形成的丝状结构与细胞相连。　　2、绿僵菌素对家蚕血淋巴蛋白质组的影响　　利用双向电泳蛋白质组学技术比较了经绿僵菌素处理和未经绿僵菌素处理的家蚕血淋巴总蛋白的表达谱，筛选出与绿僵菌素相关的家蚕血淋巴差异蛋白质点，结果显示：绿僵菌素A处理后血淋巴总蛋白与对照组比较，共检出47个表达量具有3倍以上差异的蛋白质点，其中，上调的有25个，下调的有10个，新增加的有5个，消失的有7个。表达量上调最大的蛋白质点较对照组上调18.4998倍，表达量下调最大蛋白质点较对照组下调18.2245倍。　　采用MALDI-TOF蛋白质谱技术对绿僵菌素作用于昆虫血淋巴后3倍以上差异表达的蛋白质进行了鉴定，并成功鉴定出了47个差异蛋白质点，根据各蛋白质点的功能和代谢途径差异，可将其分为：　　(1)能量代谢相关蛋白：主要为磷酸甘露糖异构酶(Mannose phosphate isomerase)(destruxin处理后新增蛋白质点)。　　(2)基因表达相关蛋白：主要包括类RM62解旋酶蛋白C(Helicase RM62-likeprotein C)(较对照组下调3.1310倍)，染色质域解旋酶DNA结合蛋白(Similar to Chd64CG14996-PB)(较对照组下调4.0731倍)，源自转座子的逆转录酶病毒相关多聚蛋白(Retrovirus-related Pol polyprotein from transposon412)(较对照组上调6.4953倍)，钙网蛋白(Calreticulin)(destruxin处理后消失的蛋白质点)等。　　(3)免疫功能相关蛋白：主要包括假定的细胞色素C氧化酶Ⅰ(Putative cytochromeC oxidase polypepfideⅠ)(较对照组下调12.6974倍)，8 kDa糖蛋白(8 kD glycoprotein)(点13较对照组上调3.4876倍；点40为destruxin处理后消失蛋白质点)，4 kD防御素(4 kD defensin)(较对照组上调3.1586倍)，血纤维蛋白溶酶组织激活素(TPA_inf：HDC20085)(点15较对照组上调6.4730倍；点27上调3.9047倍；点33上调3.8241倍)，解离素(Disintegrin)(destruxin处理后新增的蛋白质点)等。另外，钙网蛋白也是一种高度保守、主要存在于内质网上的、与细胞免疫和信号传导相关的储钙蛋白。　　(4)信号转导相关蛋白：主要包括乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)(较对照组下调3.6237倍)，钙网蛋白(Calreticulin)(destruxin处理后消失的蛋白质点)，类神经肽前体1(Neuropeptide-like precursor1)(destruxin处理后消失的蛋白质点)，类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase-like protein)(点19较对照组上调18.4998倍；点20上调8.4001倍)等。　　(5)功能未知的蛋白质：主要是一些小分子量的蛋白及糖蛋白前体和一些假想蛋白，如30 kD蛋白前体(30 kDa protein precursor)(点25较对照组上调7.7985倍；点29较对照组上调5.6296倍)，27 kD糖蛋白前体(27 kD glycoprotein precursor)(点26较对照组上调4.9677倍；点30较对照组上调3.1412倍；点41为destmxin处理后消失的蛋白质点)，保守假想蛋白(Conserved hypothetical protein)(较对照组上调5.2622倍)，假想蛋白TcasGA2_TC012558(Hypothetical protein TcasGA2_TC012558)(较对照组上调3.5211倍)等。