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基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）是锌依赖性金属肽酶蛋白家族的成员,广泛存在于植物、动物和微生物中。MMPs通过降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）参与调节许多生理过程、病理过程、伤口愈合和免疫应答等过程。但在脊椎动物中,MMPs家族基因亚型较多而且功能之间相互干扰,因此,在脊椎动物中研究MMPs的功能比较困难。而在无脊椎动物中MMPs的亚型比较少,研究起来也相对容易。东亚三角涡虫（Dugesia japonica,Dj）是扁形动物门最具有代表性的物种,因其具有强大的再生能力和高效的免疫力而被广泛关注。有研究表明MMPs参与地中海涡虫的再生和调节体内稳态的平衡,但是MMPs在涡虫的先天免疫应答中的生物学功能和调控机制尚不清楚。本研究以东亚三角涡虫为研究对象,对MMPs的结构特征、进化地位和功能进行了初步的探究。涡虫DjMMPs基因的克隆及进化分析:利用RT-PCR（reverse transcription PCR）和RACE（rapid-amplification of c DNA ends）技术克隆了东亚三角涡虫的MMPs的基因全长。DjMMP的最大开放阅读框（ORF）为1557 bp,编码518个氨基酸,包含前肽结构域、催化结构域和类血红素结构域;DjMMP1的ORF为1488 bp,编码495个氨基酸,有信号肽、前肽结构域和催化结构域;DjMMP2的ORF为1503 bp,编码500个氨基酸,有信号肽、前肽结构域和催化结构域。此外,利用RT-PCR和RACE技术克隆了DjMMPB和DjMMP9的部分序列,序列分析DjMMPB和DjMMP9具有MMPs家族特有的结构域。多序列比对发现,和人的MMPs相比,DjMMPs前肽结构域的"半胱氨酸开关"和催化结构域的保守基序基本保守。多序列比对和系统发育分析表明,这几个非典型的DjMMPs与地中海涡虫的MMPs同源基因聚为一簇,DjMMP9和脊椎动物的MMP9相似性更高。这些结果表明DjMMPs是非典型的MMPs-like基因。DjMMPs在东亚三角涡虫中的定位:利用原位杂交（In situ hybridization,ISH）研究DjMMPs在涡虫中的定位,发现DjMMP1和DjMMP2主要表达在成体涡虫咽的周围一圈,咽部有少量的表达。通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q RTPCR）检测,发现在病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）[如:脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）]刺激和截断损伤不同时间后DjMMP1和DjMMP2表达量上调。通过ISH发现DjMMP和DjMMPB都在涡虫的全身实质组织中和咽部有表达,DjMMP9都在涡虫的全身实质组织中、咽部和脑部有表达;相比正常的涡虫,在X射线辐照后的涡虫中DjMMP和DjMMPB的表达量基本没变化,而DjMMP9的表达量下降。在i H2B的涡虫中DjMMP、DjMMPB和DjMMP9的表达量下降,这些结果表明DjMMP和DjMMPB不仅在涡虫的全身实质组织中和咽部有表达,在neoblasts细胞中也有少量的表达;DjMMP9不仅在涡虫的全身实质组织、咽部和脑部有表达,在neoblasts细胞中也有少量的表达。q RT-PCR检测发现X-ray辐照后DjMMP、DjMMPB和DjMMP9的表达量上调。而在温度升高、饥饿和截断损伤后DjMMP、DjMMPB和DjMMP9的表达量,发现在不同的时间点的表达量都出现上调。这表明DjMMPs对外界刺激比较敏感。这些结果表明DjMMPs可能参与了涡虫的再生和先天免疫应答。DjMMPs参与东亚三角涡虫的先天免疫应答:为了进一步研究DjMMP1和DjMMP2的功能,对涡虫进行RNA干扰（RNA interference,RNAi）,DjMMP1缺陷和DjMMP2缺陷的涡虫没有表型变化,但是DjMMP1缺陷和DjMMP2缺陷的涡虫喂食细菌后头部出现病变和凋亡,体内细菌的清除出现了延迟。这表明DjMMP1和DjMMP2可能参与了涡虫的先天免疫应答。为了进一步研究DjMMP1的功能,我们用真核表达的蛋白进行了体外抑菌实验,结果表明DjMMP1确实具有抗菌活性。这些结果表明DjMMPs可能参与了涡虫的先天免疫应答。DjMMPs参与东亚三角涡虫的再生:为了进一步研究DjMMP的功能,对DjMMP进行了RNA干扰。发现涡虫的头部出现病变,然后开始凋亡,最终死亡。进一步研究DjMMP对涡虫再生能力的影响,发现切割3天后涡虫的头部有一半出现病变,切割5天后头部全部凋亡。而干扰DjMMP后的涡虫会导致中部和尾部再生缺陷,眼睛出现畸形。这些结果表明DjMMP参与了涡虫的再生过程。综上所述,我们首次从东亚三角涡虫中克隆了3个保守的MMPs家族基因（DjMMP、DjMMP1和DjMMP2）的全长和2个MMPs家族基因的部分序列（DjMMPB和DjMMP9）,对它们进行了基因结构、进化分析和定位的研究。首次发现涡虫里有MMP9基因并对其进行了定位,初步证明DjMMP1和DjMMP2可以通过溶菌作用清除细菌参与涡虫的先天免疫应答。发现DjMMP影响涡虫的再生能力和眼的再生。本研究不仅丰富了无脊椎动物中MMPs的相关研究进展,也为进一步研究MMPs的调控机制提供了数据支撑和理论依据。