研究目的和意义:鹰嘴豆作为新疆人民生活中的一种食品和药品,具有良好的降血糖作用。但是目前研究主要集中在鹰嘴豆异黄酮部位及皂苷部位,虽然取得了一定的研究成果,但是药效物质基础不明确,且这两个部位的降糖活性并不是很明显,只是在一定程度上去修复病理性损伤,而不能较好的逆转病理性损伤。为了更好的利用鹰嘴豆这一民族资源,开发具有较好降糖活性的降糖先导化合物,我们合成了一系列结构新颖的鹰嘴豆中异黄酮类化合物(染料木素、鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素)的衍生物并对其降糖活性进行了筛选。研究方法:根据药物化学相关知识及已有相关构效关系,设计目标化合物结构及合成路线。衍生物结构通过1H-NMR、13C-NMR以及高分辨质谱、元素分析、红外、紫外、差热-热重分析进行鉴定。选择胰岛素抵抗HepG2细胞模型,筛选具有较好降糖活性的化合物,并且根据中药多成分多靶点的特性,将降糖活性较好的化合物通过组合,希望获得降糖活性能进一步提高的降糖化合物组合。选择高糖环境下HUVEC细胞模型,来筛选在高糖环境下具有较好保护HUVEC细胞活性的化合物,希望能获得具有较好辅助治疗糖尿病周围神经病变这一并发症的化合物,期望能够获得既具有较好降糖活性又能够修复糖尿病并发症损伤的化合物。选择重组Resistin蛋白干预H4IIE细胞胰岛素抵抗模型筛选具有较好降糖活性的化合物,期望能够获得对于肥胖病人具有较好的防治糖尿病发生发展的化合物。最后,对上述三种细胞模型筛选获得的活性较好的化合物在人肝细胞L02胰岛素抵抗模型上进行筛选,期望在人肝细胞L02上获得具有较好降糖活性的化合物。并对染料木素铬元素配合物进行了 db/db小鼠体内试验,来研究该配合物在动物体内的降糖活性。研究成果:通过结构修饰及鉴定,获得了 114个异黄酮衍生物。通过胰岛素抵抗HepG2细胞模型筛选(共筛选118个化合物,有4个是实验室前期合成的,在表格中已标注,下述不同细胞模型筛选均筛选了 1 18个化合物),获得了化合物F1、H、J1、N、C5、E5、K5、Q5以及染料木素具有更优的降糖活性,并探讨了其构效关系,但活性均不如阳性药盐酸二甲双胍(p<0.05或p<0.01)。通过对这些具有较好降糖活性的化合物及染料木素进行化合物组合并进行胰岛素抵抗HepG2细胞模型筛选,获得了四个组合具有较好的降糖活性:第一批化合物(化合物A-T、A1-T1、A2-T2)中组合6(染料木素、化合物H、化合物J1)与组合10(化合物J1、染料木素、化合物F1)具有较好降糖活性,组合6和组合10的最大浓度降糖活性与阳性药盐酸二甲双胍相比,差异无统计学意义(p>0.5)。并且组合6和组合10的最大浓度降糖活性远远强于其他各组最大浓度降糖活性(p<0.05或p<0.01)。在与阳性组相同剂量条件下(500μmol/L),组合10具有和阳性组相似的降糖活性(p<0.05)。第二批化合物(化合物A3-T3、A4-T4、A5-T5)中组合3(染料木素、化合物E5、化合物K5)和组合6(化合物C5、化合物E5、化合物K5)具有较好降糖活性,组合3和组合6与阳性药盐酸二甲双胍在相同剂量(500μmol/L)条件下,降糖活性差异无统计学意义(p>0.05),在1000μmol/L和500μmol/L剂量条件下,组合3和组合6的降糖活性优于其他各组合,差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。高糖环境下HUVEC细胞模型筛选获得具有较好的保护高糖环境下HUVEC细胞活性的是化合物E、L、R2、A4、Jl、E4、D5、M5,但是这些化合物的活性均不如阳性药(弥可保)(p<0.05或p<0.01)。对上述获得的4个组合进行高糖环境下HUVEC细胞模型筛选,发现第一批化合物中的组合6和组合10具有较好的HUVEC保护活性,组合6和组合10对于HUVEC的保护活性差异具有统计学意义(p<0.05),组合10的保护活性优于组合6。组合6和组合10与阳性组相比,组合10在1000μmol/L剂量条件下与阳性组(500μmol/L)效果相当(p>0.05),组合6则在最大剂量条件下与阳性组差异具有统计学意义(p<0.05),活性不如阳性组。组合6和组合10之间LDH(乳酸脱氢酶)、MDA(丙二醛)、SOD(总超氧化物歧化酶)活性、NO含量的差异亦有统计学差异(p<0.05或p<0.01),组合10与组合6相比明显降低了高糖损伤HUVEC的LDH和MDA含量,明显增加了高糖损伤HUVEC的NO含量和SOD活性。由此得出,组合10能够更好的保护高糖损伤的HUVEC,在后续研究中,可能能够发挥更好的降糖作用以及对于糖尿病并发症更好的修复作用。重组Resistin蛋白干预H4IIE细胞胰岛素抵抗模型筛选获得具有较好活性的是化合物J4、H3、B1、F2,但是这些化合物的活性均不如阳性药(盐酸罗格列酮)(p<0.05或p<0.01)。对上述获得的4个组合进行重组Resistin蛋白干预H4IIE细胞胰岛素抵抗模型筛选,发现第二批化合中的组合3和组合6具有较好的活性。发现在无胰岛素刺激的情况下,组合3具有比组合6更强的刺激H4IIE细胞合成糖原的作用(p<0.05),并且组合3在与阳性组相同剂量(500μmol/L)条件下,与阳性药刺激糖原合成的作用相当(p>0.05)。在胰岛素刺激条件下,组合3仍具有比组合6更强的刺激H4IIE细胞合成糖原的作用(p<0.05),并且组合3在与阳性组相同剂量(500μmol/L)条件下,与阳性药刺激糖原合成的作用相当(p>0.05)。说明组合3具有比组合6更好的刺激在resistin干预条件下,H4IIE细胞合成糖原的作用。这也说明组合3对于肥胖病人糖尿病的发生及发展能够起到潜在的预防和治疗作用。通过人肝细胞L02胰岛素抵抗模型筛选获得具有较好降糖活性的化合物是:化合物J1、D5、E5、F1、H、N、C5,其中HepG2细胞胰岛素抵抗模型初期筛选获得的具有较好降糖活性的化合物F2、01、K5、L5、Q5等在L02细胞胰岛素抵抗模型中没有表现出较好的降糖活性,说明L02细胞胰岛素抵抗模型与HepG2细胞胰岛素抵抗模型是有一定的差别的,这可能与L02细胞表面表达的胰岛素受体与HepG2细胞不同有关。染料木素铬配合物的db/db小鼠体内降糖活性研究表明,该配合物可以较明显的改善db/db小鼠体重,空腹血糖,随机血糖,肝体比,肾体比(与C57组相比,差异无统计学意义),以及改善了 db/db小鼠OGTT(口服葡萄糖耐量测试)和ITT(胰岛素耐量试验)的表现。对肝脏、肾脏、胰腺、骨骼肌组织形态学观察,也具有明显改善及修复。对db/db小鼠血清指标的影响方面,对于TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)无明显改善,与模型组无明显差异,但HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)与模型组相比,差异明显,有较好改善作用。另外本团队还对该配合物的毒性进行了考察,没有发现其具有潜在的毒性。结论及意义:通过对鹰嘴豆中异黄酮类化合物染料木素、鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素进行结构修饰获得了若干降糖活性优于母体化合物的衍生物,但并没有获得降糖活性与阳性药相当的衍生物。通过对其中活性较好的化合物进行组合,获得了具有和阳性药活性相当的化合物组合,并且其中的某些组合在其他类型与糖尿病相关细胞模型的筛选中也表现出与阳性药相当的活性,说明通过多成分多靶点的作用,能够产生单个化合物无法获得的活性,这也为中药化学成分的开发利用提供了一定的参考。通过对染料木素铬元素配合物的体内活性研究表明,该配合物具有较好的体内降糖活性,且未发现潜在毒性,具有一定的成药潜力。