目的:在动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病中,病变的血管表现为管壁增厚、管腔狭窄、细胞外基质沉积、血管壁顺应性下降。血管壁的炎症贯穿心血管疾病发生发展的全过程,是血管系统对损伤因子应激所引起的防御反应。作为血管壁的重要细胞成分,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的炎症和增殖是血管重塑性疾病共同的病理生理基础。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是心血管疾病发病机制中的明星分子,有抑制血管炎症和增殖的作用。环状RNA是一类特殊的内源性非编码RNA,呈共价闭合环状结构。其作用广泛,现已证明有如下几个作用:可以做为“mi RNA海绵”在转录后水平调节线性mRNA稳定性;与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)结合形成蛋白质-RNA复合体调控下游信号通路;促进线性亲本基因的转录;编码蛋白质等。因此,环状RNA能够参与调控包括VSMC在内的各种细胞的增殖、凋亡、衰老、分化等生命活动。本研究以Sirt1基因外显子来源的环状非编码RNA circ-Sirt1为研究对象,揭示circ-Sirt1上调血管平滑肌细胞SIRT1表达的机制及意义。方法:体外培养大鼠VSMCs,采用腺病毒过表达circ-Sirt1,siRNA敲低circ-Sirt1,qRT-PCR和Western blot方法评价circ-Sirt1与SIRT1表达的关系;利用Rip、RNA pull-down、FISH结合荧光素酶报告基因的方法确定circ-Sirt1参与SIRT1的表达调节。用Western blot和免疫共沉淀分析考查circ-Sirt1介导的SIRT1表达对NF-κB p65核转位和乙酰化水平的影响;建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型并利用腺病毒体内过表达circ-Sirt1,利用HE染色从形态学角度直观展现circ-Sirt1与VSMCs的增殖关系。结果:1 circ-Sirt1上调SIRT1表达的分子机制1.1 circ-Sirt1上调SIRT1的表达我室前期研究发现,circ-Sirt1定位于VSMCs胞浆且特异性高表达。为确定circ-Sirt1能够在转录后水平调节亲本基因SIRT1的表达,对VSMCs敲低和过表达circ-Sirt1,qRT-PCR和Western blot检测其亲本基因SIRT1 mRNA和蛋白表达变化。结果表明,circ-Sirt1能在转录后水平正向调控SIRT1表达。1.2 circ-Sirt1与miR-132/212-3P直接相互作用采用生物信息学预测发现circ-Sirt1上存在3个mi R-132/212-3P潜在结合位点。用抗Ago2抗体进行RIP实验,结果表明,与对照抗Ig G抗体相比,抗Ago2抗体能够富集到circ-Sirt1。提示circ-Sirt1对mi RNAs可能存在相互作用。进一步使用生物素或FAM标记的miR-132/212-3P作为探针,利用RNA-pull down结合qRT-PCR以及细胞原位杂交实验证实,circ-Sirt1在细胞内直接与miR-132/212-3P相互作用。以上结果表明,circ-Sirt1可以作为“分子海绵”吸附miR-132/212-3P。1.3.circ-Sirt1可解除miR-132/212-3P对SIRT1 mRNA模板活性的抑制作用生物信息学预测发现,SIRT1 3’-UTR区含有miR-132/212-3P的结合位点。我们推测circ-Sirt1可能通过竞争性结合miR-132/212-3P从而调控SIRT1蛋白的表达。为了验证这一推测,我们将circ-Sirt1全长序列克隆到pGL3荧光素酶报告基因载体上,与miR-132/212-3P mimics共转染293A细胞。结果显示,与转染对照mi RNA mimics相比,miR-132/212-3P mimics能显著抑制报告基因的表达活性。将SIRT1 3’-UTR区含miR-132/212-3P结合位点的序列克隆到荧光素酶报告基因pGL3质粒上,与miR-132/212-3P mimics共转染HEK293A细胞。结果显示,mi R-132/212-3P mimics能明显抑制报告基因表达活性。若上述序列突变,报告基因活性不能被miR-132/212-3P mimics所抑制。结合上一部分的结果,表明circ-Sirt1可能通过与miR-132/212-3P结合,进而调控SIRT1 mRNA的表达。为确定circ-Sirt1过表达是否能够解除miR-132/212-3P对SIRT13’-UTR区的结合和抑制,我们将含有SIRT1 3’-UTR区miR-132/212-3P结合位点的报告基因质粒、miR-132/212-3P mimics及circ-Sirt1表达载体pcDNA-circ-Sirt1共转染HEK293A细胞。结果显示,过表达circ-Sirt1能够部分补救miR-132/212-3P对SIRT1 3’-UTR区的结合和抑制。此外,我们在circ-Sirt1过表达的VSMCs中转染miR-132/212-3P mimics,qRT-PCRs和Western blot结果显示,miR-132/212-3P均能够抑制SIRT1的表达,而过表达circ-Sirt1可解除miR-132/212-3P对靶基因SIRT1的抑制,不同程度上调SIRT1的表达。这些结果提示,在VSMCs中,circ-Sirt1通过竞争性结合mi R-132/212-3P从而解除其对SIRT1蛋白表达的抑制作用。2 circ-Sirt1介导的SIRT1表达促进NF-κB p65去乙酰化失活2.1 circ-Sirt1抑制p65的激活我室前期研究表明,VSMCs胞浆中的circ-Sirt1通过与NF-κB p65结合而将其锚定于胞浆,抑制TNF-α所诱导的NF-κB p65核转位,发挥抑制VSMCs炎症应答的作用。然而,进一步研究发现,circ-Sirt1介导的NF-κB p65核转位抑制是不完全的,且与被p65所调控炎症分子ICAM等的表达减少程度之间存在很大差距。我们推测这种差距,是因为已发生核转位的NF-κB p65的活性受到抑制所导致。为证明这一推测,我们通过Ch IP和DNA pull-down分析检测细胞核中NF-κB p65的DNA结合活性。结果显示,过表达circ-Sirt1的VSMCs细胞核中NF-κB p65的活性几乎被完全抑制。进而,构建pNF-κB–luc质粒,TNF-α刺激细胞6 h,p NF-κB–luc质粒与pcDNA-circ-Sirt1质粒以不同比例转染293A细胞,荧光素酶报告基因检测NF-κB p65的转录活性。结果证实,随着pcDNA-circ-Sirt1质粒转染量的增加,NF-κB p65活性逐渐下降,最终与无刺激组持平。以上结果提示,过表达circ-Sirt1不仅可以抑制NF-κB p65核转位,还能抑制核转位的NF-κB p65的转录活性。2.2 circ-Sirt1上调SIRT1表达促进p65去乙酰化失活以往研究表明,SIRT1能够使NF-κB p65去乙酰化失活,发挥抑制炎症应答的效应。Western blot结果显示,TNF-α诱导的NF-κB p65乙酰化水平在胞浆和胞核内表达均升高,且乙酰化主要集中在核内。过表达circ-Sirt1能够升高核内的SIRT1表达水平,显著降低TNF-α诱导的核内NF-κB p65乙酰化水平。免疫共沉淀结果显示,circ-Sirt1过表达的细胞中,TNF-α诱导的NF-κB p65乙酰化受抑制,与增加的SIRT1与NF-κB p65相互作用相吻合。以上结果表明,circ-Sirt1能够在转录后水平上调SIRT1的表达,后者促进核内NF-κB p65去乙酰化失活,这可能是circ-Sirt1抗炎、发挥血管保护作用的新机制。2.3 circ-Sirt1抑制体内血管炎症应答为进一步证实circ-Sirt1在体内是否也能够抑制炎症应答,对大鼠行颈总动脉内皮剥脱术,建立颈总动脉球囊损伤模型,设立Ad-circ-Sirt1组(n=6)、Ad-Vector阴性对照组(n=6)和PBS空白对照组(n=6),在手术损伤后的14 d取大鼠颈总动脉组织。qRT-PCR结果证实,体内过表达circ-Sirt1成功。Western blot结果显示,与对照组相比,在给予Ad-circ-Sirt1的损伤血管组织中,炎症标志物血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule 1,ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)表达减少。HE结果显示,大鼠颈总动脉在损伤14 d后,三组损伤血管均出现新生内膜弥散性增厚,管腔变窄,中膜平滑肌细胞排列紊乱的现象。但是,Ad-circ-Sirt1组的内膜增生程度明显小于其他两组。以上结果表明,circ-Sirt1在体内能够抑制血管的炎症应答和内膜增生。3 circ-Sirt1抑制c-Myc核转位和血管平滑肌细胞增殖3.1 circ-Sirt1抑制血管平滑肌细胞增殖鉴于炎症和增殖的密切联系,我们用PDGF-BB(20ng/mL)刺激大鼠VSMCs以诱导其增殖表型。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,PDGF-BB刺激组circ-Sirt1在24 h、48 h的表达量显著下降,SIRT1 mRNA表达变化呈现相同趋势。此外,在增殖状态的VSMCs中过表达circ-Sirt1,细胞计数和MTT结果显示,与对照组相比,circ-Sirt1过表达48 h后,细胞数目明显减少。提示过表达circ-Sirt1抑制PDGF-BB所诱导的VSMCs增殖。Western blot结果进一步显示,过表达circ-Sirt1可抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖标志分子增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达,促进分化标志物平滑肌蛋白22α(smooth muscle protein 22α,SM22α)的表达。以上结果表明,circ-Sirt1抑制平滑肌细胞增殖。3.2 circ-Sirt1与c-Myc存在相互作用利用RNA-Protein Interaction Prediction(RPISeq)软件筛选circ-Sirt1可能结合的增殖相关的蛋白质。进一步利用RIP和RNA pull-down进行验证,发现circ-Sirt1与c-Myc之间存在相互作用关系。3.3 circ-Sirt1抑制c-Myc核转位为探讨circ-Sirt1对增殖通路的调节机制,体外培养的VSMCs过表达circ-Sirt1,PDGF-BB刺激1 h后分离胞浆胞核组分,Western blot检测c-Myc核转位。结果表明,过表达circ-Sirt1抑制PDGF-BB所诱导的c-Myc核转位;Chip实验显示,过表达circ-Sirt1抑制核内c-Myc的DNA结合活性。以上结果表明,circ-Sirt1通过抑制c-Myc的核转位,抑制VSMCs增殖。结论:1.circ-Sirt1作为“分子海绵”吸附miR-132/212-3P,解除其对SIRT1mRNA的抑制作用,上调SIRT1表达。2.circ-Sirt1介导的SIRT1表达,促进NF-κB P65去乙酰化失活。3.circ-Sirt1通过与c-Myc结合,抑制PDGF-BB诱导的核转位,从而抑制VSMCs增殖。4.circ-Sirt1是一种新的NF-κB抑制因子。