目的：研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)后适应对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并探讨其与PI3K/Akt和ERK1/2信号通路的关系。方法：1.大鼠H9c2细胞的缺氧/复氧模型的建立用含10%FBS的DMEM培养基培养24h后,换用预先经95%N2+5%CO2昆合气饱和的缺氧液,然后放入通有95%N2+5%CO2的37℃培养箱缺氧培养若干小时,复氧时换用无FBS的DMEM培养基,在正常培养条件下培养若干小时,MTT测定细胞存活率。选择适宜的缺氧复氧时间,建立缺氧/复氧模型。2.S1P后适应对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其(?)PI3K/Akt信号通路的关系。将培养的大鼠H9c2细胞随机分为5组,即(1)正常对照组(C组)；(2)缺氧/复氧(H/R)组；(3)S1P组；(4)S1P+LY组；(5)LY组。C组换用无血清的DMEM培养；H/R组缺氧培养16h,复氧培养4h；S1P组在复氧时加入终浓度为4μM S1P复氧培养4h；S1P+LY组在复氧时加入终浓度为10μM的LY294002(PI3K/Akt抑制剂)预处理30min,再同时加入终浓度为4μM SIP复氧培养3.5h；LY组在复氧时加入终浓度为10μM的LY294002复氧培养4h。MTT法测定各组细胞存活率；比色法测定细胞培养液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、总超氧化物歧化酶(Total super oxide dismutase, T-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Manganese super oxide dismutase, Mn-SOD)活力；Fluo-3AM标记细胞内游离钙离子,激光共聚焦显微镜检测荧光强度；流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率；Western Blot法测定H9c2细胞中p-Akt(?)t-Akt蛋白的表达水平。3.S1P后适应对H9c2胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其(?)ERK1/2信号通路的关系。将培养的大鼠H9c2细胞随机分为5组,(1)～(3)组同上；(4) S1P+PD组：(5)PD组。S1P+PD组在复氧时加入终浓度为50μM的PD98059(ERK1/2抑制剂)预处理30rmin,再同时加入终浓度为4μM S1P复氧培养3.5h；PD组在复氧时加入终浓度为50μM的PD98059复氧培养4h。MTT法测定各组细胞存活率；比色法测定细胞培养液中MDA含量、T-SOD和Mn-SOD活力;Fluo-3AM标记细胞内游离钙离子,激光共聚焦显微镜检测荧光强度；流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率；Western Blot法测定H9c2细胞中p-ERK1/2(?)t-ERK1/2蛋白的表达水平。结果：1.大鼠H9c2细胞的缺氧/复氧模型的建立用缺氧16h、复氧4h制备模型时,细胞出现皱缩、破裂等,与正常对照组组相比(100%±0),细胞存活率(67.2%±5.62%)显著降低,且降低程度适当,结果重复性好,确定后续实验采用此模型。2.S1P后适应对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其和PI3K/Akt信号通路的关系。与H/R组相比,S1P组的细胞存活率明显升高(73.13%±1.21%vs60.44%+3.19%,P<0.01)；细胞培养液中MDA含量明显降低(1.57±0.050nmol/L vs3.86±0.069nmol/L, P<0.01)、T-SOD (19.46±1.31U/ml vs10.67±1.44U/ml, P<0.01)及Mn-SOD (9.24±0.77U/ml vs6.60±0.97U/ml, P<0.01)活力显著提高；细胞内钙离子的荧光强度明显降低(0.75±0.043vs2.77±0.11,P<0.01),细胞凋亡率显著降低(16.80%±0.57%vs28.83%±1.23%, P<0.01)。加入PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002以后,S1P+LY组与S1P相比细胞存活率明显降低(63.41%±2.74%vs73.13±1.21%,P<0.01);细胞培养液中MDA含量明显升高(2.94±0.072nmol/L vs1.57±0.050nmol/L, P<0.01)、T-SOD (13.60±1.46U/ml vs19.46±1.31U/ml,P<0.01)及Mn-SOD (5.01±0.61U/ml vs9.24±0.77U/ml, P<0.01)活力显著降低；细胞内钙离子的荧光强度明显升高(1.27±0.038vs0.75±0.043, P<0.01),细胞凋亡率显著升高(23.46%±0.91%vs16.80%±0.57%,P<0.01)。Western Blot结果显示,与C组相比,H/R组p-Akt蛋白的表达明显增加(P<0.01)；与H/R组相比,S1P组能明显增加p-Akt蛋白的表达(P<0.01)；与S1P组相比,加入LY294002以后p-Akt蛋白的表达明显降低(P<0.01)。3.S1P后适应对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其和ERK1/2信号通路的关系。加入ERK1/2信号通路阻断剂PD98059以后,S1P+PD组与S1P例比细胞存活率明显降低(62.64%±4.54%vs73.13%±1.21%, P<0.01);细胞培养液中MDA含量明显升高(3.04±0.097nmol/L vs1.57±0.050nmol/L,P<0.01)、T-SOD(13.54±2.53U/ml vs19.46±1.31U/ml, P<0.01)及Mn-SOD (5.11±0.64U/ml vs9.24±0.77U/ml, P<0.01)活力显著降低；细胞内钙离子的荧光强度明显升高(1.27±0.032vs0.75±0.043, P<0.01),细胞凋亡率显著升高(27.6%±0.83%vs16.80%±0.57%, P<0.01)。Western Blot结果显示,与C组相比,H/R处理能使p-ERK1/2蛋白表达明显增加(P<0.01)；与H/R组相比,S1P组能明显增加p-ERK1/2蛋白的表达(P<0.01)；与S1P组相比,加入PD98059以后p-ERK1/2蛋白的表达明显降低(P<0.01)。结论：1.用缺氧16h、复氧4h制备H9c2细胞缺氧/复氧损伤模型,细胞存活率降低程度适当,结果重复性好,符合制备模型标准。2.4μM的S1P能够提高缺氧/复氧损伤后的H9c2细胞存活率,减少脂质过氧化损伤,提高细胞内的抗氧化酶活性,减轻细胞内钙离子超载、减少细胞凋亡,从而抵抗缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤。3.本文首次发现,S1P能够促进缺氧/复氧损伤后的H9c2细胞中P-Akt的表达,加入PI3K/Akt抑制剂LY294002以后S1P的保护作用被取消,表明S1P通过PI3K/Akt信号通路抗缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤；另外S1P能够上调缺氧/复氧损伤后的H9c2细胞中P-ERK1/2的表达,加入ERK1/2抑制剂PD98059以后S1P的保护作用被取消,表明S1P还通过ERK1/2信号通路抗缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤。