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补体系统是机体固有免疫的重要组成部分,可通过经典途径、凝集素途径和替代途径而被激活,发挥其生物学效应。启动凝集素途径活化的第一个补体组分是甘露糖结合凝集素(mannan-binding lection,MBL)/纤维胶原素(ficolin,FCN)与MBL-相关丝氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin associated serine protease,MASP)结合形成的复合物。MASP家族由MASP-1、MASP-2、MASP-3丝氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白组成,其中MASP-2是参与凝集素途径活化的重要组分。MAp19是MASP-2的剪切体,其氨基酸序列分析显示仅比MASP-2羧基端前两个功能区多四个氨基酸残基。MAp19能与MBL结合,但无催化功能,它是否与MASP-2存在竞争抑制作用尚待进一步研究证实。此外发现MAp19与肾病、骨髓瘤以及SARS等疾病存在一定相关性。本课题拟在构建pcDNA3.1/Myc-HisA-MAp19真核表达载体,表达的重组MAp19蛋白,为后续研究其功能奠定基础。首先应用PCR技术扩增得到MAp19基因。采用切胶回收的方法纯化PCR产物。将MAp19片段和真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His A进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切凝胶回收各片段。将MAp19片段和真核表达载体pc DNA3.1/Myc-His A的酶切产物以T4连接酶进行连接。将MAp19重组质粒采用热休克法导入感受态细菌E.coli BL21中,将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养板上培养过夜。采用MAp19特异性引物及pcDNA3.1/Myc-His A通用引物进行Cross-PCR初筛LB平板上长出的单个菌落,并进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒进行测序。测序结果与Genbank公示的MAp19标准序列比对完全一致,未发现移码现象,即成功构建pcDNA3.1/Myc-HisAMAp19重组真核表达载体。确定重组真核载体构建成功后,将其通过脂质体介导技术转染到HeLa细胞中。48h后,细胞固定、封闭、用鼠抗c-Myc抗体孵育后再经过Alexa Flour488标记羊抗小鼠IgG(H+L)染色,荧光显微镜下观察MAp19在细胞内的表达。设置不同梯度浓度的G418选择培养基,确定G418对HeLa细胞的最小药物致死浓度。并采用该浓度的G418选择性培养基对转染后的HeLa细胞进行选择性培养,选择荧光较强的HeLa细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,从而获得整合有pcDNA3.1/Myc-HisA-MAp19的阳性细胞克隆再进行扩大培养。收集细胞培养上清及细胞裂解液,经Anti-c-Myc agarose翻转吸附纯化,而后进行Western blot,用鼠抗c-Myc抗体以及HRP标记山羊抗鼠IgG孵育,结果可见转染了重组质粒的细胞培养上清和裂解液中有阳性条带,分子量约为19.84KDa,与c-Myc-HisA-MAp19融合蛋白分子质量大小相符,提示该融合蛋白成功表达。