目的:酒精性肝病(ALD)是长期大量饮酒所致的肝脏损害性病变,其病理改变包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。关于ALD的发病机理目前尚不清楚,近年来有人提出以氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说,“第一次打击”指脂质沉积在肝细胞,导致脂肪肝,“第二次打击”涉及内毒素、细胞因子参与的氧化应激和脂质过氧化。胰岛素是体内重要的代谢调节物,胰岛素受体(INSR)广泛分布在全身各组织细胞膜上,与胰岛素结合后使胰岛素受体底物(IRS)酪氨酸磷酸化激活,将胰岛素信息向细胞内传递。当体内的胰岛素无法发挥正常的生理功能而需要更多的胰岛素才能完成正常的生理功能时,可以认为出现了胰岛素抵抗,胰岛素抵抗状态进一步可引起肝脏脂肪变。AMPK存在于线粒体内,属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员,其信号通路是调节细胞能量状态的中心环节,在发生磷酸化修饰后影响众多酶促反应,降低固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的合成,促进ATP合成,同时抑制ATP分解,在增加脂肪酸氧化、提高胰岛素敏感性及改善氧化应激等方面发挥重要作用。SREBP是调节脂肪生成的转录因子,有促进肝内脂肪合成的作用。二甲双胍是目前糖尿病治疗中的一线用药,可以改善代谢紊乱状态,改善胰岛素抵抗,且是腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)的变构激活剂,因而二甲双胍可能通过AMPK提高胰岛素敏感性,降低肝内脂肪合成等方式预防酒精性肝病的第一次打击,即脂质沉积在肝细胞导致脂肪肝的发生,对于酒精性肝病有预防与治疗作用。本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,应用酒精合并二甲双胍灌胃建立二甲双胍干预组,观察二甲双胍对酒精性肝病的预防作用。通过分析一般情况及血清指标变化,应用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法观察AMPK、INSR、SREBP蛋白及mRNA的表达情况,以探讨上述指标在ALD中的变化及二甲双胍对其的影响,为有效防治ALD提供新的实验及理论依据。方法:选用雄性健康清洁级Wistar大鼠30只,体重200±20g,正常饲养1周后随机数字表法分为3组:正常对照组(N),模型组(M),干预组(I),每组10只。模型组和干预组动物每日上午9时酒精灌胃(30%-60%, 5-9g/kg/d),干预组动物每日下午15时二甲双胍水溶液灌胃(80mg/ml, 200mg/kg/d)。于16周末禁食12h后3组动物分别处死10只、8只、8只,留取血清及肝组织标本。应用日本OLYMPUS AU-600全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乙酰胆碱酯酶(CHE)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血糖(GLU)及放射免疫γ计数仪检测胰岛素(INS),并计算胰岛素敏感指数(ISI);取部分肝组织立即冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,观察肝细胞脂肪变性情况;另取肝组织固定于4%中性福尔马林溶液,石蜡包埋,5μm切片行苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织的普通病理改变;并用石蜡切片进行AMPK、INSR、SREBP等免疫组织化学染色,观察肝组织上述指标蛋白表达情况;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用RT-PCR观察大鼠肝组织AMPK、INSR、SREBP等mRNA的表达。结果:1一般情况比较:试验结束时3组间体重无统计学差异(p>0.05);模型组肝脏重量和肝指数(肝重/体重)大于其它两组,且有统计学意义(p<0.05);干预组与正常对照组差异无统计学意义(p>0.05)。2肝功能及血脂指标的变化:模型组ALT、AST、TG、LDL、VLDL较正常对照组高,CHE、HDL较正常对照组低,均有统计学意义(P<0.05)。干预组各项指标均较模型组有所缓解,ALT、CHE、TG与模型组有统计学意义(P<0.05);干预组与正常对照组之间ALT、AST、HDL、VLDL的差异有统计学意义(p<0.05);TC三组间差异无统计学意义(p>0.05)。3血糖、胰岛素及相关指数改变:模型组血糖及胰岛素高于其他两组,胰岛素敏感指数低于其他两组,均有统计学意义(p<0.05);干预组与正常对照组之间差异无统计学意义(p>0.05)。4肝组织病理变化:正常对照组肝组织肝细胞呈单核多层状,肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射样排列,偶有脂变;模型组大鼠肝细胞弥漫性小泡性脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成;干预组病理改变较酒精组有所减轻。5免疫组化法检测大鼠肝组织AMPK、INSR、SREBP蛋白的表达:模型组AMPK表达较正常对照组减少,干预组改善不明显;模型组INSR表达比正常对照组少,干预组介于两者之间;模型组SREBP表达高于正常对照组,干预组则有所改善。6 RT-PCR法检测AMPK、INSR、SREBPmRNA的表达量:与正常组比较,模型组AMPK、INSR表达减少,SREBP表达增加,且有统计学差异(p<0.05);干预组各项指标较模型组均有所改善,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠ALD模型,该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床ALD的基本病变。2胰岛素抵抗、代谢紊乱存在于ALD的发病过程中。3 ALD过程中存在肝脏AMPK、SREBP、INSR等表达改变。4二甲双胍可以通过调节AMPK、SREBP、INSR来改善胰岛素抵抗,减轻肝脏脂肪变性。5二甲双胍有望成为酒精性肝病的新的预防、治疗药物。