目的:临床验方补肾通络方脱胎于三大千年名方,在江苏省中医院骨科已经成功应用于绝经后骨质疏松症的治疗数十年。然而,补肾通络方治疗骨质疏松症的效应机理仍不清楚。本研究假设补肾通络方可能作用于骨吸收与血管生成从而构成治疗绝经后骨质疏松症的机制。以补肾通络方为研究对象,对方剂的物质基础,疗效机理以及有效物质的筛选进行一系列研究,以试图揭示补肾通络方通过上调血管生成信号因子,抑制骨吸收从而构成骨保护机制,干预卵巢切除所导致的骨丢失和灌注不足。方法:由于补肾通络方在临床使用时为汤剂,因此首先优化方剂的水溶性成分提取方式以及确定浓缩工艺,为后续实验打下基础。为提高研究可重复性,通过高效液相法对方剂提取物的化合物图谱进行建立,并结合标准品对方剂中标志性化合物进行鉴定,从而对方剂的药材和提取质量进行控制。这一部分工作又通过液相色谱-质谱联用法予以验证,结合标准品对方剂中的对应化合物进行化学结构指认。动物实验共分为5组。其中随机选择10只大鼠进行假手术(假手术组,n=10),保留完整卵巢,另40只大鼠切除双侧卵巢。切除卵巢后大鼠随机分为四组,分别每日灌胃给予水(对照组,n=10),补肾通络方(6g/kg组,n=10),补肾通络方(12g/kg组,n=10)以及雌二醇(雌激素组,10μg/kg,n=10)。连续分别给药12周。骨丢失情况与微循环障碍通过股骨远端显微断层扫描(μCT)完成。股骨中段生物力学测试借助三点弯曲试验测定。股骨远端松质骨中破骨细胞和内皮细胞的分布通过免疫组织化学染色实施。通过实时荧光PCR与免疫印迹法对血管生成信号通路中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及血管内皮生长因子(VEGF),以及破骨细胞分化相关的信号因子降钙素受体(CALCR),组织蛋白酶K(CTSK),核因子κB受体活化子配体(RANKL),骨钙素(OPG),以及(β-catenin)mRNA与蛋白表达碱性磷酸酶(ALP)活性属于特征性的骨形成代谢指标,通过结合萤光素酶报告基因手段量化细胞活力,从而指示药物干预成骨细胞碱性磷酸酶活力和细胞活力两个维度的信息,并最终形成参数化指标反映不同药物对成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响,从而进一步筛选补肾通络方的效应物质。结果:从补肾通络方中通过高效液相色谱法和超高效液相-高分辨质谱联用法共同鉴定出6种潜在有效成分,分别为没食子酸、绿原酸、芍药内脂、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ、甘草酸。在大鼠卵巢切除术诱发的骨质疏松症模型中,补肾通络方特异性的保护了松质骨组织的骨密度,提高了骨力学强度并保护了骨小梁显微结构。在股骨远端干髌端,补肾通络方显著降低了卵巢切除术后降钙素受体和组织蛋白酶K的mRNA和蛋白表达,并且抑制了骨吸收速率。补肾通络方可下调模型动物RANKL表达,降低RANKL/OPG比值。同时,补肾通络方增加了卵巢切除动物模型股骨远端血管体积,促进血管生成。补肾通络方通过稳定HIF-1α进而上调VEGF表达水平。通过结合萤光素酶报告基因手段量化了补肾通络方中各有效成分不同药物溶剂对成骨细胞产生的影响,测定了各成分对成骨细胞碱性磷酸酶的校正活力。与其他化合物的效能进行比较,淫羊藿苷与川续断皂苷Ⅵ可显著性提高成骨细胞碱性磷酸酶活力。结论:在卵巢切除术诱导的高转化型骨质疏松大鼠模型中,补肾通络方抑制骨吸收和破骨细胞激活。补肾通络方的骨保护机制包括了稳定HIF-1α,上调下游血管活性因子VEGF等表达,从而抑制RANKL/OPG比例。本研究提供了补肾通络方取代激素替代疗法,治疗绝经后骨质疏松症尤其伴随微循环功能障碍者的有力证据。从补肾通络方中鉴定出多种潜在有效成分,其中淫羊藿苷与川续断皂苷Ⅵ可提高成骨细胞碱性磷酸酶活力,可能是补肾通络方干预骨质疏松的部分机制。