家蝇蛹凝集素纯化及其免疫活性的研究

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家蝇生长在充满多种微生物的环境中,自身却不受病原菌的侵袭,其独特的免疫防御记住已成为国内外研究的热点之一。近年来,关于家蝇体内活性物质的研究主要有多酚氧化酶、抗菌蛋白/肽、溶菌酶和一些其它的分泌物,其中,关于家蝇抗菌蛋白/肽的研究最多。然而,有关家蝇血淋巴具有免疫活性的凝集素报道很少。   本文应用超滤浓缩和溴化氰活化的Sepharose4B亲和层析法从家蝇蛹血淋巴中分离出一种具有免疫活性的新型家蝇蛹凝集素,其活性可被D-半乳糖抑制,最低抑制浓度为15.6 mM,对经过胰蛋白酶处理过的兔血红细胞具有明显的凝集作用(最佳作用浓度为20μg/mL),其活性不依赖于Ca2+的存在并且在pH7-9范围内和4℃-40℃范围内保持相对稳定。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析其为单一成分的蛋白,其相对分子质量为55 kDa。聚丙烯酰胺凝胶电泳的希夫试剂染色表明此种新型家蝇蛹凝集素具有糖链结构,借助蛋白质测序仪、肽指纹图谱、分光光度计比色、β-消除反应、红外光谱、以及原子力显微镜技术对其结构进行初步分析,此种家蝇蛹凝集素是一种蛋白和糖含量分别为97.36%和2.1%的球状糖蛋白单体,直径为75 nm左右,肽链与糖链的连接方式为O-糖苷键型,但肽链的N-末端封闭,肽指纹图谱表明其序列与β-1微管蛋白(gi|158739,来源为果蝇)具有高度相似性,为进一步分析其结构提供了可靠的依据。   体内实验表明,给正常小鼠注射不同剂量的凝集素后小鼠的脾脏指数、胸腺指数、吞噬指数和半数溶血值(HC50)与对照组相比具有显著差异(P<0.05),其中凝集素浓度为12 mg/kg时小鼠的HC50与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)。   观察了家蝇蛹血淋巴及其纯化物凝集素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。以不同浓度血淋巴及凝集素与脾淋巴细胞、T细胞和B细胞共孵育72 h,采用MTT法测定淋巴细胞的吸光度值,观察它们对淋巴细胞增殖的促进作用,采用免疫印迹法研究提取物对B淋巴细胞增殖的信号转导通路。与对照组相比,血淋巴冻干粉、分子量在50 kDa以上的冻干粉及凝集素对混合淋巴细胞和B细胞增殖有显著促进作用,然而对于T细胞的增殖却没有明显的促进作用。免疫印迹结果表明凝集素激活了B淋巴细胞的ERK通路,促进了B淋巴细胞的增殖。家蝇蛹血淋巴及其纯化物凝集素具有免疫调节作用,为天然免疫增强剂的开发提供了一定的参考依据。
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