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目的在各种近视眼发病机制学说中,“视网膜局部调控学说”备受瞩目,该学说认为视网膜感知外界环境变化后产生一级近视信号因子(如视黄酸,RA)并作用于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE),使之产生二级信号因子(如TGF-β2),进而调控巩膜的生长,形成近视。本实验观察全反视黄酸(ATRA)对豚鼠RPE细胞的生长、分泌TGF-β2的影响及细胞内第二信使cAMP、IP3的变化。并研究磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536分别对视网膜色素上皮细胞生长及分泌TGF-β2影响,分析RPE细胞分泌TGF-β2的相关胞内信号传导途径,进一步探讨RPE在近视发生发展中的呈递作用。方法选取健康3周龄花色豚鼠,麻醉处死后摘取眼球,采用组织消化法分离培养豚鼠RPE细胞,上皮细胞特异的角蛋白免疫组化染色鉴定,取第2-3代对数生长期的细胞用于后续实验。实验细胞于使用前均换无血清培养液培养24小时以使其同步化。1. ATRA组：用MTT法检测不同浓度(5×10-6M,10×10-6M,40×10-6M)ATRA对豚鼠RPE细胞增殖的影响。选取浓度为10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞,分别于2h、4h、6h、8h、16h取上清培养液用ELISA方法检测TGF-β2的分泌量；于0min、5min、30min、2h、6h收集细胞裂解液用ELISA和放射免疫的方法分别检测胞内cAMP和IP3的含量变化。2.磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536组：用MTT法检测不同浓度(5×10-6M,10×10-6M,15×106M,20×10-6M)U73122和(5×10-6M,10×10-6M,20x10-6M,50×10-6M)SQ22536对豚鼠RPE细胞增殖的影响。取浓度为1×10-5M的U73122、SQ22536作用于豚鼠RPE细胞,分别于2h、4h、6h、8h、16h用ELISA方法检测TGF-β2的分泌量。结果1. RPE细胞原代培养及鉴定：原代培养的豚鼠RPE细胞48小时后已贴壁生长,细胞含有丰富的色素。传代后色素减少,细胞近融合时形态近六角形。免疫组化角蛋白染色RPE细胞为棕黄色阳性反应。2. ATRA对豚鼠RPE细胞的影响MTT检测：40×10-6M的ATRA作用RPE细胞24h后,细胞生长明显受到抑制。5×10"6M和10×10-6M的ATRA对RPE细胞的生长的作用与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。TGF-β2的检测：加入10×10-6MATRA后,TGF-β2的分泌量与对照组相比,2h、4h、6h明显升高,8h无显著差异,16h降低(P<0.05),呈随时间延长分泌量逐渐下降趋势。cAMP及IP3的检测：加入含10×10-6MATRA的培养液后,RPE胞内cAMP含量在30min和2h时升高(p＜0.05),5min、6h时与对照组相比无明显差别。而胞内的IP3含量在各时间点均显著降低(p<0.05),6h时降低最明显。3.磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536对豚鼠RPE细胞的影响MTT检测：5×106M浓度U73122作用豚鼠RPE细胞24h后,MTT结果与对照组无显著差异(p>0.05),浓度>5×10-6M时均明显低于对照组(p<0.01)。并随浓度的增OD值降低越明显。而SQ22536组RPE细胞生长无明显变化(p>0.05)。TGF-β2的检测：加入1×10-5M U73122后,TGF-β2的分泌量除2h无显著差异外,余各时间点均较对照组明显增加(P<0.05)；而SQ22536组对RPE细胞分泌TGF-β2在2h,4h,6h,16h无明显影响(p>0.05),8h时分泌量降低(P<0.05)。结论1.较高浓度的ATRA及U73122对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用,而SQ22536对RPE细胞生长无明显影响。2.10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞后,TGF-β2的分泌量短期升高,随时间延长而降低。3.10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞后,IP3含量显著降低,cAMP含量在观察时间段中期有升高,后又降至对照组水平。4.U73122可使RPE细胞分泌TGF-β2增加,而SQ22536对RPE TGF-β2的分泌无明显影响。研究结果提示RPE细胞的增殖与第二信使IP3有关。ATRA对RPE细胞分泌TGF-β2的影响可能与第二信使IP3的降低有关。而抑制磷脂酶C信号通路后,RPE细胞分泌TGF-β2增加,进一步证实了豚鼠RPE细胞分泌TGF-β2与磷脂酶C信号通路有关。