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目的本研究以颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)大鼠模型为研究对象,以电针治疗为干预手段,研究电针治疗对TBI大鼠模型脑神经细胞凋亡的调控效应,以及该效应与PI3K/AKT信号通路之间的关联,以期揭示电针治疗TBI的部分效应机制,为TBI的电针治疗提供科学依据。方法选用160只SD大鼠(SPF级),随机(随机数字表法)分为空白组(10只)、假手术组(30只)、模型组(30只)、阻断剂组(30只)、电针+阻断组(30只)、电针组(30只)。在阻断剂组、电针+阻断组应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,于造模(自由落体撞击法)术后24 h开始电针治疗(电针组、电针+阻断组),选穴:“百会、水沟、曲池、内关、足三里、涌泉”,每天1次,共治疗14 d。(1)对造模前1 d、电针治疗后3 d、7 d、14 d大鼠的行为学功能进行评价(平衡、行走、及神经功能等),对各评价时间点大鼠损伤脑组织的病理形态学(HE染色)改变和脑细胞凋亡情况(TUNEL法)进行观测,对各时间点大鼠血清中NSE(神经元特异性烯醇化酶)浓度进行观测,评价电针对TBI大鼠的治疗效应。(2)运用免疫荧光、Western-blot实验技术通过一系列实验从不同层次和角度,对经电针治疗后TBI大鼠损伤脑组织中细胞凋亡因子(促凋亡:Bad、bak、bax;抗凋亡:bcl-xl、NF-k B、Bcl-2)的表达情况进行观测,探讨电针治疗对TBI大鼠脑神经细胞凋亡因子的调节作用,及该效应与PI3K/AKT通路与之间的关联。(3)运用免疫荧光、Western-blot、Real-time PCR实验技术通过一系列实验从不同层次和角度,对电针治疗后TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K、PDK1、AKT、p-AKT及其m RNA的表达情况进行检测,分析该通路关键蛋白表达量的变化与通路阻断剂(LY294002)及电针干预之间的关联。结果(1)行为学评价:造模前各组大鼠行为学功能评分之间比较,P>0.05;治疗后3 d、7 d、14 d相应评价时间点行为学功能评分,假手术组与空白组之间,P>0.05;在3个相应评价时间点,假手术组行为学功能评分结果优于模型组(P<0.01),而模型组结果优于阻断剂组(P<0.05);治疗后3 d,电针组大鼠的平衡、行走功能评价结果与模型组相比,P>0.05,而两组间其他行为学评价结果(神经功能、肢体回缩力)分别进行比较,P<0.05;治疗后7 d、14 d电针组大鼠的行为学功能评价结果均优于模型组(P<0.05);治疗后3个评价时间点,电针组评价结果均优于电针+阻断组(P<0.05);电针+阻断组与阻断剂组之间相比,在治疗后3 d、7 d,P>0.05,14 d时,P<0.05。(2)病理形态学:TBI大鼠损伤脑组织病理切片HE染色结果:治疗后3 d、7 d、14 d假手术组和空白组之间相比差异不明显,且结构正常;治疗后3 d:模型组大鼠的损伤脑组织炎症、水肿、核固缩现象较为明显;阻断剂组大鼠的损伤脑组织病理形态结构改变最为明显,受损部位有炎性细胞浸润、渗出较多、间质出血及水肿严重,组织空泡样改变明显,且出现坏死区域,坏死区细胞正常形态消失、不规则排列,核固缩及裂解明显;电针组大鼠的脑组织形态结构表现与模型组之间差异不明显,但优于电针+阻断组;阻断剂组与电针+阻断组之间差异不明显;治疗后7 d、14 d:模型组大鼠的损伤脑组织炎症、水肿较前减轻,核固缩现象明显;阻断剂组大鼠的损伤脑组织病理形态结构改变最为明显,受损部位炎性细胞浸润较前增加、渗出较前减少、间质水肿严重,组织空泡样改变较前明显,坏死区域变大,且坏死区细胞正常形态消失,核固缩及裂解较前增加;电针组大鼠脑组织形态结构表现明显优于模型组、电针+阻断组,阻断剂组与电针+阻断组之间可见差异。(3)血清中NSE的浓度:ELISA检测大鼠血清中NSE(神经元特异性烯醇化酶)浓度:治疗后3 d、7 d、14 d,假手术组与空白组间相比,P>0.05,模型组浓度均高于假手术组(P<0.01),阻断剂组浓度高于模型组(P<0.05);治疗后3 d电针组与模型组相比,P>0.05;治疗后7 d、14 d电针组浓度低于模型组,P<0.01;治疗后的3个检测时间点,电针组浓度均低于电针+阻断组(P<0.01);阻断剂组与阻断+电针组相比较(治疗后3 d、7 d:P>0.05,14 d:P<0.05)。(4)脑细胞凋亡情况:TUNEL法凋亡检测结果(以凋亡检测荧光图像平均光密度值高低表示):治疗后3 d、7 d、14 d,假手术组与空白组相比,P>0.05,模型组高于假手术组(P<0.01),阻断剂组高于模型组(P<0.01);治疗后3 d,电针组与模型组相比,P>0.05,电针组低于电针+阻断组(P<0.05);治疗后7 d、14 d电针组低于模型组(P<0.01),且低于电针+阻断组(P<0.05);在治疗后各时间点阻断剂组与电针+阻断组间比较,P>0.05。(5)促细胞凋亡蛋白的变化:免疫荧光(IF)、Western-blot检测TBI大鼠损伤脑组织中Bad、bak、bax的表达情况(以IF图像平均光密度值高低表示):治疗后3 d、7 d、14 d的各相应时间点,假手术组与空白组间相比,P>0.05;模型组高于假手术组(P<0.05),模型组低于阻断剂组(P<0.05);在治疗后3 d,电针组与模型组间相比,P>0.05,而电针组低于电针+阻断组(P<0.05);在治疗后7 d、14 d的各相应时间点,电针组低于模型组(P<0.05),且低于电针+阻断组(P<0.05);阻断剂组与电针+阻断组相比较,在治疗后3 d时,Bad、bak、bax检测结果P>0.05,在治疗后7 d时Bad、bak检测结果P>0.05,bax检测结果P<0.05,在治疗后14 d时,Bad、bak、bax检测结果P<0.05。(6)抗细胞凋亡蛋白的变化:IF、Western-blot检测TBI大鼠损伤脑组织中bcl-2、NF-k B、bcl-xl的表达情况(以IF图像平均光密度值高低表示):在治疗后3 d、7 d、14 d的各相应检测时间点,假手术组与空白组之间相比,P>0.05,模型组与假手术组之间相比,P<0.05,模型组高于阻断剂组(P<0.05);在治疗后3 d,电针组与模型组之间相比,P>0.05,而电针组高于电针+阻断组(P<0.05);在治疗后7 d、14 d的各相应时间点,电针组高于模型组(P<0.05),且高于电针+阻断组(P<0.01);阻断剂组与电针+阻断组相比较,bcl-xl在治疗后3个相应检测时间点,P>0.05,而bcl-2、NF-k B在治疗后3 d、7 d时,P>0.05,14 d时,P<0.05。(7)PI3K、PDK1、AKT、p-AKT的变化IF检测:IF检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的表达情况(以IF图像平均光密度值高低表示):治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组各指标与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量与模型组相比,P>0.05;治疗后7 d、14 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于模型组(P<0.05);治疗后的3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于电针+阻断组(P<0.01),阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。在各相应检测时间点,电针组AKT的磷酸化水平(p-AKT)表达量高于模型组(P<0.05),且高于电针+阻断组(P<0.01),此外,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。(8)PI3K、PDK1、AKT、p-AKT的变化Western-blot(W-b)检测:Wb检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的表达情况:治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组各指标的表达量与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d,电针组PI3K、PDK1的表达量与模型组相比,P>0.05,电针组AKT的表达量高于模型组(P<0.05);治疗后7 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于模型组相比(P<0.05);治疗后14 d,电针组PI3K、PDK1的表达量高于模型组(P<0.05),电针组AKT的表达量与模型组相比P>0.05;在3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于电针+阻断组(P<0.01),阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05;在电针后各相应检测时间点,电针组AKT的磷酸化水平(p-AKT)表达量高于模型组(P<0.05),且高于电针+阻断组(P<0.01),此外,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。(9)PI3K、PDK1、AKT m RNA的变化Real-time PCR检测:Real-time PCR检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白m RNA的表达情况:治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d,电针组PI3K、PDK1的m RNA表达量与模型组相比,P>0.05,电针组AKT m RNA的表达量高于模型组(P<0.05);治疗后7 d、14 d电针组PI3K、PDK1、AKT的m RNA的表达量高于模型组(P<0.05);在3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的m RNA的表达量高于电针+阻断组(P<0.01),阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。结论(1)电针可有效改善TBI大鼠的行为学功能,减轻损伤脑组织的渗出、炎症、水肿,降低TBI大鼠血清中NSE的浓度,促进TBI的恢复。(2)电针干预可下调TBI大鼠损伤脑组织中Bad、bak、bax蛋白的表达,上调Bcl-2、NF-k B、bcl-xl蛋白的表达,从而抑制脑神经细胞的凋亡。(3)电针干预可上调TBI大鼠损伤脑组织中PI3K、PDK1、AKT、p-AKT及其m RNA的表达,且该效应受抑制剂LY294002的影响。(4)电针干预对TBI大鼠行为学功能和病理形态学的改善,以及对TBI大鼠脑神经细胞凋亡的抑制而发挥的治疗效应与PI3K/AKT信号通路相关。