研究背景:牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一种牙源性的间充质干细胞,由Seo等于2004年首次从人牙周膜组织中鉴定并分离得到。研究显示,PDLSCs具有良好的自我更新能力和多项分化潜能,可分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞等特殊的细胞类型。进一步的证据表明PDLSCs还具备一定的免疫调节功能和较低的免疫原性,易于从乳牙、阻生的第三磨牙或正畸拔除的前磨牙中获取,在骨组织工程中具有广阔的应用前景。然而,PDLSCs作为一个复杂而异质性的群体,即使在相同条件下也可能反映出不同的生物学特性,这限制了其作为干细胞的应用。在牙齿的发生发育过程中,起源于颅神经嵴(cranial neural crest,CNC)的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)迁徙并分化为各种间充质细胞系,最终形成牙髓、牙本质、牙骨质和牙周膜。有学者认为,在牙齿发育完成后,部分CNC源性的祖细胞会留存在牙周膜中,成为PDLSCs中一个更加始祖的亚群;而更精准地分离出这个亚群将促进PDLSCs在未来成功应用于临床治疗。p75神经营养因子受体(p75neurotrophin receptor,p75NTR)是一种高度保守的跨膜的神经营养因子/神经营养因子前体蛋白受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族。p75NTR的作用并不局限于神经系统,其在非神经组织的发育和分化过程中也具有多重生物学功能。此外,p75NTR在CNC来源的干细胞中高表达,被认为是CNC源性干细胞的一种特异性表面标志物。在前期研究中,本课题组以p75NTR为细胞表面标志物从大鼠体内分离出CNC源性的p75NTR~+EMSCs,发现其具有优良的多向分化潜能;不仅如此,p75NTR还参与了EMSCs成骨分化的正向调控。然而,基于p75NTR表达分选PDLSCs的研究报道较少,p75NTR对PDLSCs生物学特性的影响及其作用机制也尚不清楚。本研究旨在利用p75NTR作为细胞表面标志物分选人PDLSCs,观察p75NTR对PDLSCs再生潜能的影响并进一步探讨其中的潜在机制。我们希望找到一种优化的细胞表面标志物来鉴定和纯化PDLSCs,从而促进其在骨组织工程中的应用。方法:第一部分:PDLSCs的p75NTR流式分选经医院伦理委员会批准及患者知情同意后,收集18至25周岁接受正畸治疗的患者拔除的健康前磨牙,刮取牙周膜组织,采用酶消化法收集原代PDLSCs并进一步体外培养至第3代细胞。以p75NTR为细胞表面标志物,用荧光激活细胞分选术分选PDLSCs并收集p75NTR~+PDLSCs和p75NTR~-PDLSCs。选取第4代p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs,用流式细胞术检测三种细胞表面p75NTR和间充质干细胞相关表面标志物的表达,并用免疫荧光验证三种细胞中p75NTR的表达。第二部分:p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs生物学特性的研究选取第4代p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs:(1)常规培养10d后,用结晶紫染色观察三种细胞的克隆形成单位,计算其克隆形成率。(2)常规培养7d,每天用CCK-8法检测三种细胞的增殖能力。(3)用流式细胞术检测三种细胞的凋亡率。(4)成脂诱导21d后,用油红O染色观察三种细胞的成脂分化水平。(5)成软骨诱导21d后,用阿利新蓝染色观察三种细胞的成软骨分化水平。(6)成骨诱导7d和21d后,分别用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红染色观察三种细胞的成骨分化水平。(7)成骨诱导前及成骨诱导7d后,分别用荧光定量逆转录聚合酶链反应(fluorescent quantitation reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)和Western blot检测三种细胞中p75NTR、ALP和Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX2)的m RNA和蛋白的表达。第三部分:p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs的RNA测序(RNA Sequencing,RNA-seq)和差异分析选取第4代p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs,常规培养3d后收集三种细胞的总RNA。经RNA质检、文库构建与质检、Illumina测序、测序数据质控、基因定量分析后,用DESeq2软件对数据进行统计学分析,得到三种细胞的差异基因表达谱,并进一步用Cluster Profiler软件对p75NTR~+和p75NTR~-PDLSCs中的差异表达基因进行富集分析,筛选出存在差异的关键信号通路。最后,从差异基因表达谱中选择五种与该信号通路相关的基因:层粘连蛋白α1(laminin alpha 1,LAMA1)、Ⅳ型胶原蛋白α1(collagen typeⅣalpha 1,COL4A1)、整合素α1(integrin alpha 1,ITGA1)、整合素α7(integrin alpha7,ITGA7)及整合素α8(integrin alpha 8,ITGA8),用q RT-PCR检测其m RNA的表达,验证RNA-seq的结果。第四部分:p75NTR通过ITGA1优化PDLSCs骨向分化潜能的机制探讨选择ITGA1作为p75NTR~+和p75NTR~-PDLSCs中与成骨分化有关的关键差异表达基因。选取第4代p75NTR~+PDLSCs:(1)利用小干扰RNA转染沉默细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证沉默效果。(2)ITGA1沉默后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。选取第4代p75NTR~-PDLSCs:(1)利用腺病毒转染过表达细胞中的ITGA1,并用免疫荧光验证过表达效果。(2)ITGA1过表达后对细胞成骨诱导3d,用ALP染色观察其骨向分化水平的变化,用q RT-PCR检测其ITGA1、p75NTR、ALP、RUNX2、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达,用Western blot检测其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达。结果:第一部分:流式分选结果显示:PDLSCs中p75NTR~+PDLSCs的比例为0.99%±0.38%,p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs的形态未见明显差异,大部分呈梭形,具有MSCs的外形特征。分选后的流式细胞表型鉴定结果显示:p75NTR~+PDLSCs中p75NTR的表达率为60.59%,而p75NTR~-和未分选PDLSCs中p75NTR的表达率分别为0.55%和1.31%;三种细胞均高表达人MSCs阳性表面标志物(CD44/CD73/CD90/CD105),且均低表达人MSCs阴性表面标志物(CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR)。免疫荧光结果显示:p75NTR~+PDLSCs中p75NTR的荧光强度高于p75NTR~-和未分选PDLSCs。第二部分:p75NTR~+、p75NTR~-和未分选PDLSCs的结晶紫染色结果显示三种细胞的克隆形成率未见明显差异。CCK-8检测结果显示三种细胞连续7天的增殖能力未见明显差异。流式细胞术检测结果显示三种细胞的凋亡率未见明显差异。油红O和阿利新蓝染色结果显示三种细胞均能向成脂肪细胞或成软骨细胞分化。ALP和茜素红染色结果显示三种细胞均能向成骨细胞分化,且p75NTR~+PDLSCs的骨向分化水平强于p75NTR~-和未分选PDLSCs。q RT-PCR和Western blot检测结果显示:在成骨诱导前,p75NTR~+PDLSCs中p75NTR m RNA和蛋白的表达高于p75NTR~-与未分选PDLSCs,而三种细胞中ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达未见明显差异;在成骨诱导7d后,三种细胞中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达均升高,且p75NTR~+PDLSCs中p75NTR、ALP和RUNX2 m RNA和蛋白的表达高于p75NTR~-和未分选PDLSCs。第三部分:RNA-seq结果显示:p75NTR~+与p75NTR~-PDLSCs相比有713个基因上调,754个基因下调;p75NTR~+与未分选PDLSCs相比有458个基因上调,410个基因下调;p75NTR~-与未分选PDLSCs相比有214个基因上调,196个基因下调。KEGG通路分析显示:p75NTR~+和p75NTR~-PDLSCs中的差异表达基因涉及多条信号通路,其中ECM-receptor interaction信号通路可能与PDLSCs的成骨分化密切相关。q RT-PCR检测结果显示:p75NTR~+PDLSCs中ITGA1、ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达均高于p75NTR~-PDLSCs,与RNA-seq结果一致。第四部分:在p75NTR~+PDLSCs中沉默ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达降低。ALP染色结果显示其骨向分化水平减弱。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达降低,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达降低。在p75NTR~-PDLSCs中过表达ITGA1后,免疫荧光结果显示其ITGA1的表达升高。ALP染色结果显示其骨向分化水平增强。q RT-PCR检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2 m RNA的表达升高,但其ITGA7、ITGA8、LAMA1及COL4A1 m RNA的表达未见明显变化。Western blot检测结果显示其ITGA1、p75NTR、ALP及RUNX2蛋白的表达升高。结论:1、p75NTR可用于分选PDLSCs以获取CNC源性的干细胞亚群。2、p75NTR~+PDLSCs较p75NTR~-和未分选PDLSCs具备更高的骨向分化潜能。3、p75NTR~+和p75NTR~-PDLSCs中的差异表达基因涉及ECM-receptor interaction信号通路,且p75NTR~+PDLSCs较p75NTR~-PDLSCs表达更高水平的ITGA1。4、ITAG1作为ECM-receptor interaction信号通路中的关键受体,在成骨诱导的环境下,可以正向调控PDLSCs的成骨分化。综上所述,本研究首次证实p75NTR可用于分离骨向分化潜能较好的同质的PDLSCs。此外,p75NTR可以通过ECM-receptor interaction信号通路上调ITGA1的表达并优化PDLSCs的骨向分化潜能,提示p75NTR可以作为一种新的细胞表面标志物来识别和纯化PDLSCs,并促进其在骨组织工程中的应用。