论文部分内容阅读
大肠杆菌是医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-TolC外输泵是最主要的外输泵，能够输出多种抗生素、化疗试剂、洗涤剂和染料类。如果使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。穿越大肠杆菌的内膜和外膜，可使药物直接外输到介质中的AcrAB-TolC系统共包含AcrA、AcrB和TolC三个部分。AcrA是膜融蛋白，它的功能是与一个位于内膜、属于RND（耐药性结瘤）家族的含有12个α-螺旋的转运子的AcrB及外膜通道TolC相连接。TolC基因的突变不能改变大肠杆菌对药物的敏感性。本实验欲检测临床分离的动物源性大肠杆菌的AcrA、AcrB基因的mRNA和蛋白的表达水平，寻找AcrA、AcrB基因的表达水平与大肠杆菌多重耐药水平的相关性，实验共分三个部分。 动物源性多重耐药大肠杆菌的分离与鉴定 临床分离132株来自不同动物的动物源性大肠杆菌，经微生物学镜检和生化反应鉴定后，采用药敏纸片法进行对22种抗生素的耐药性检测结果表明：132株动物源性大肠杆菌的耐药以多重耐药为主。采用平皿二倍稀释法对随机选择的40株大肠杆菌的最低抑菌浓度的测定结果表明，多重耐药的水平相当严重。从中选择13株不同动物源性的不同耐药水平的多重耐药大肠杆菌供进一步研究用。 临床分离多重耐药大肠杆菌AcrA、AcrB基因的mRNA水平的定量测定 内标准DNA的构建 分别另设计4条引物，共8条引物，用基因合成法分别经过3次（6个）PCR，在目的片段中间成功地插入一个外源的约250bp的基因片段，从而首次用合成法构建一个定量RT-PCR的内标准DNA。 AcrA、AcrB基因的RT-PCR 提取菌体总RNA，取等量的RNA立即进行反转录。反转录引物为Oligo-dT，RT-PCR产物经琼脂糖电泳检测到目的带。 受试大肠杆菌的mRNA水平的检测 将内参依次二被稀释后，在同一反应管中加入等体积的RT产物和不同稀释度的内参，直至找到扩增产物经琼脂糖电泳后，一条泳道上的两条目的带的亮度相当时的内参的浓度。 多重耐药大肠杆菌AcrA、AcrB基因的mRNA的水平的比较 分别将与耐药株的反转录产物量相当的内参稀释度和与大肠杆菌药敏质控株ATCC25922的反转录产物量相当的内参稀释度做比较的结果表明：对氟喹诺酮类药物恩诺沙星耐药 (MIC≥32μg·ml-1)的埃希氏大肠杆菌的AcrA、AcrB的mRNA水平与15号质控菌株的AcrA、AcrB的mRNA水平相比均有所提高，对氟喹诺酮类药物恩诺沙星耐药（MIC≥16μg·Inl‘）的2、13号埃希氏大肠杆菌的ACrA、ACrB的InRNA水平与15号质控菌株的ACfA、ACrB的InRNA水平相当。与15号质控菌株的ACfA、ACrB基因的InRNA的水平，同一菌株的AerA与ACrB基因的InRNA的水平基本一致，可能是由于H者由一个操纵子调控的原因。 临床分离多重耐药大肠杆菌AcrA蛋白表达水平的检测 AcrA、AcrB部分基因的克隆及原核表达 从大肠杆菌上分别扩增出除掉信号肽的长约696hp的AcrA基因片段、带有酶切位点的长约MZbp的AcrB。基因片段，将其克隆到 PMD－18T载体上，经 PCR和酶切鉴定为阳性克隆后，进行核甘酸序列分析的结果表明，克隆到的A。rA基因序列与报道过的基因序列的同源性为99．8％，所编码的氨基酸没有改变，克隆到来源于三株大肠杆菌的ACrB基因片段的序列与报道过的基因序列的同源性分别为94．5％、93．3％、93．5％，所编码的氨基酸序列与报道过的氨基酸序列的同源性分别为100％、97厂％、98．l％，三株大肠杆菌的A。rB基因片段序列的突变位点基本一致。将构建好的 AcrA－Pet28a（＋）、AcrB．Pet28a（＋）原核表达质粒分别转化到受体菌 BLZ； DE。)中，经 IFTG诱导后，检测到 AcrA外源基因的表达，未检测到AcrB外源基因的表达。 AcrA蛋白抗体的制备 用纯化后的表达产物免疫獭兔，经ELASA 和Western－Blotting检测结果表明，在国内首次获得了 AcrA蛋白的抗体。 受试菌株的AcrA蛋白的Western－Blotting检测 用制得的AcrA抗体首次对我国动物源性大肠杆菌受试菌株的AcrA蛋白的Western－Blotting检测结果表明，随机B雅的4株大肠杆菌的AcfA蛋白的表达水平与药敏质控株K［’tC25922的AcrA蛋白的表达水平，均有不同程度的提高，敏感株的ACrA蛋白的表达水平与药敏质控株ATCC25922的AcrA蛋白的表达水平基本相当，与药敏质控株相比，同一菌株的AcrA蛋白的相对表达水平与其InRNA的相对水平基本一致。 本研究结果表明，我国动物源性的大肠杆菌的耐药以多重耐药为主，耐药水平较高；大肠杆菌同一菌株的ACfA与A。rB基因的InRN的水平是基本一致的；与药敏质控株相比，ACrA的InKN A水平与其蛋白表达水平基本一致；多重耐药大肠杆菌的InRNA和蛋白表达水平与对氟隆诺酮类药物思诺沙星的耐药水平有一定的相关性，与多重耐药株对其他药物的耐药水平之间的关系尚待进一步研究。