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目的:大麻素(cannabinoids,CBs)系统作为人体内主要的神经化学系统,具有广泛的生物学效应,包括镇痛、神经保护、免疫和内分泌等。N-花生四烯酸氨基乙醇(arachidonyl ethanolamide,AEA)是目前发现的主要内源性大麻素(endogenous cannabinoids,EC)样物质之一,AEA通过与大麻素受体结合发挥作用,具有重要的生物学功能,不仅可以诱导组织的毒性刺激,还可以促进炎症和组织修复。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)在多种炎症性疾病的基质降解中起着重要作用,主要降解细胞外基质内胶原和蛋白等多种成分,目前研究认为其分类之一MMP-2是参与牙髓和根尖周病变的重要致病因子。课题组前期已证实人成牙本质细胞(human odontoblasts,HODs)上大麻素受体1型(cannabinoid type1 receptor,CB1)的功能性表达,因此AEA可能在HODs中发挥调控功能。本实验利用体外建立的HODs样细胞模型,首先观察AEA在HODs样细胞中对MMP-2蛋白表达发挥的调控作用,其次探寻调控作用发生的潜在分子机制,预测和验证调控MMP-2表达相关的微小核糖核酸(micro ribonuclenic acid,mi RNA),进一步验证mi RNA在AEA调控HODs样细胞MMP-2表达的过程中发挥关键作用。本研究旨在探讨内源性大麻素AEA调控HODs样细胞MMP-2表达相关的mi RNA,为今后牙髓病和根尖周病临床治疗奠定一些实验基础。方法:本实验通过About I等人建立的方法诱导HODs样细胞,利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)分析特异性标志物牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoproteins,DSPP)和牙本质巢蛋白(nestin)表达来鉴定培养的HODs样细胞。用10mmol/L AEA作用HODs样细胞0、12、24、48、72h后通过Western blot(WB)分析MMP-2的蛋白水平随时间变化趋势,再用不同浓度AEA作用HODs样细胞一定时间后通过WB分析MMP-2蛋白水平随AEA浓度变化趋势。为了研究调控MMP-2表达的潜在分子机制,通过靶基因预测软件Target Scan和mi RDB预测并筛选出目标mi RNA与MMP-2结合区域,根据结合区域碱基序列构建野生型和突变型增强绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)MMP-2 3’UTR质粒、预测的mi RNA过表达质粒和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)mi RNA,进行EGFP报告载体实验验证预测的mi RNA是否可以直接靶向作用MMP-2 3’UTR。为了进一步验证预测的mi RNA对MMP-2表达有调控作用,在HODs样细胞中过表达或封闭预测的mi RNA后通过q PCR和WB检测MMP-2的表达水平,从而确定预测的mi RNA可以调控MMP-2表达。在上述研究的基础上,进一步通过挽救实验来分析AEA、过表达预测的mi RNA和MMP-2表达的相关性,通过q PCR和WB检测MMP-2的表达水平来分析预测的mi RNA过表达后AEA的调控变化,从而确定调控发生的分子机制。结果:IF和q PCR结果显示培养的细胞中DSPP和nestin呈阳性表达,鉴定为HODs样细胞可用于后续实验。WB结果显示10mmol/L AEA作用HODs样细胞24h后MMP-2蛋白水平开始明显上调,72h后达到与阳性对照(TNF-α)相当的水平,证实MMP-2蛋白水平与AEA作用时间呈正相关,以72 h作用上调效果最明显;不同浓度AEA作用HODs样细胞72h后,10mmol/L AEA处理组最先达到与阳性对照(TNF-α)相当的水平,12mmol/L AEA处理组达到蛋白水平最高峰,证实随着AEA浓度的增加MMP-2蛋白水平上调越明显。靶基因预测软件Target Scan和mi RDB预测并筛选出MMP-2为mi R-136的靶基因,EGFP报告载体实验结果显示过表达mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度显著降低,封闭mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度增加;然而,过表达mi R-136或封闭mi R-136对突变型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度没有明显变化,证实mi R-136能够直接靶向作用于野生型MMP-2 3′-UTR。q PCR和WB结果显示HODs样细胞中过表达mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平显著降低,封闭mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平升高,说明mi R-136可对MMP-2表达进行转录后调控。AEA作用HODs样细胞不同时间后,q PCR结果显示AEA下调mi R-136表达水平;HODs样细胞过表达mi R-136后再进行AEA处理,q PCR和WB实验结果显示单独过表达mi R-136能下调MMP-2的m RNA和蛋白水平,单纯AEA处理能上调MMP-2的m RNA和蛋白水平,而过表达mi R-136+AEA处理可以部分上调MMP-2的m RNA和蛋白水平,证实AEA可以部分解除HODs样细胞中由过表达mi R-136介导的MMP-2表达抑制作用。结论:该研究表明AEA可显著上调HODs样细胞中MMP-2的表达水平;AEA通过mi R-136来调控HODs样细胞中MMP-2的表达。