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目的:哺乳动物雷帕霉秦素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它主要调控细胞的生长与存活。前人的研究表明,mTOR对调节视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的功能,维持细胞存活,起到重要作用。临床上干性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)晚期的地图状萎缩的形成表现为早期的RPE细胞的丢失,继而伴随着光感受器细胞的退化和视网膜的增厚。为了研究mTOR究通路和干性AMD的关系,本研究构建了组织特异性基因敲除小鼠模型,敲除了 RPE细胞中的mTOR抑制因子结节性脑硬化复合体1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)来探究从基因水平直接激活mTOR通路对RPE细胞的影响。此外,我们还对小鼠进行了腹腔注射雷帕霉素,探索干性AMD治疗的新靶点。方法:本研究分三部分进行。第一部分,我们利用cre-loxp系统建立条件性基因敲除(conditional knockout,cKO)小鼠模型,通过提取小鼠尾巴DNA来进行基因型鉴定。同时我们在蛋白水平验证造模是否成功:取9周cKO小鼠(Tsc1f/f Best1-Cre)和对照鼠(Ksc1f/f),处死小鼠后摘除眼球,去前节和玻璃体,进行冰冻切片的Cre免疫荧光染色;取20周小鼠,进行RPE-脉络膜的平铺片Tsc1免疫荧光染色。我们还检测了 mTOR信号通路是否发生了改变:蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测14周和26周小鼠RPE-脉络膜复合体中mTOR通路相关蛋白和磷酸化蛋白的表达水平;对眼摘AMD病人的视杯冰冻切片进行mTOR、TSC1、s6、p-s6(s6Ser235/236)免疫荧光染色,探索目标蛋白在组织中的定位;对照临床病人冰冻切片免疫荧光染色情况,通过小鼠视杯p-s6的免疫荧光染色,检测小鼠模型中RPE细胞的mTOR通路是否被激活。第二部分,我们探究了 AMD小鼠模型的形态学和功能改变。取16周、28周和50周的cKO小鼠和对照鼠,使用美多丽散瞳后,拍摄小鼠眼底照;通过石蜡HE染色、透射电镜,观察RPE细胞和视网膜结构的变化;使用4%水合氯醛麻醉小鼠,进行小鼠视网膜电流图检测;取30周小鼠的视杯进行冰冻切片,油红染色观察bruch膜是否有脂质沉积;qPCR和蛋白免疫印迹法(WB)检测RPE65及RPE细胞相关分子标志的表达水平;对20周龄小鼠的视杯的冰冻切片和RPE-脉络膜平铺片分别进行RPE65/PNA和细胞骨架染色,观察RPE65荧光强度和细胞形态的变化;通过cKO小鼠和对照鼠RPE-脉络膜平铺片ZO-1、β-catenin、磷酸化形式β-catenin(β-cateniniTyr489)的免疫荧光染色,检测RPE细胞连接是否有改变。第三部分,我们利用mTOR抑制剂雷帕霉素对小鼠进行药物治疗。cKO和对照组小鼠分别每天腹腔注射雷帕霉素或溶剂。western blot和冰冻切片免疫荧光染色药物治疗2个月后,治疗或非治疗的cKO和对照组小鼠的RPE-脉络膜复合体中s6和p-s6水平的差异;通过石蜡HE染色,观察RPE细胞结构的变化;对14周龄小鼠的冰冻切片进行RPE65荧光染色,观察RPE65荧光强度的变化;western blot检测12周时小鼠RPE65及RPE细胞相关分子标志的表达水平;通过RPE-脉络膜平铺片β-catenin和p-β-catenin的免疫荧光染色,检测RPE细胞连接是否有改善。结果:第一部分,通过若干代配繁后经基因鉴定得到实验所需的cKO小鼠和对照鼠。检测到cKO鼠中,Cre蛋白在RPE细胞呈马赛克形式表达,对应的细胞中Tsc1蛋白表达明显下降、mTOR通路被激活。第二部分,cKO小鼠视网膜的形态学和电生理出现了类似于临床AMD患者的表型。与对照组小鼠相比,cKO小鼠眼底黑色素分布不均,出现视网膜萎缩;ERG反应b波振幅显著降低。视网膜外核层厚度变薄;RPE65及RPE细胞相关分子标志的表达水平显著降低;RPE细胞增厚,六边形结构及微绒毛消失,细胞内出现空泡,细胞间紧密连接受损;粘附连接蛋白β-catenin胞质中增多磷酸化形式p-β-catenin的荧光强度明显增强而且细胞核也有所表达。第三部分,经药物治疗2-3个月后,与注射溶剂的同龄cKO小鼠相比,注射雷帕霉素的cKO小鼠mTOR通路的p-s6降低,且RPE细胞内黑色素有所保留,RPE65及其他RPE相关分子蛋白的表达上升。同时,细胞边界中黏附蛋白β-catenin的信号变得清晰,p-β-catenin的荧光强度大大减弱。结论:利用cre-loxp系统建立的特异性敲除RPE细胞中Tsc1基因的小鼠模型能较好的模拟AMD的发病过程。该小鼠模型中RPE细胞的mTOR通路异常激活,继而影响了细胞的生长、增殖,出现了干性AMD的地图状萎缩(geography atrophy,GA)等表型。雷帕霉素的治疗能抑制cKO小鼠RPE细胞中mTOR通路的异常激活、缓解RPE细胞的退化。由此我们推断雷帕霉素可能成为治疗干.性年龄相关性黄斑变性AMD的有效药物,为该疾病的提供新的潜在治疗靶点。目的:遗传性视网膜变性疾病(inhereted retinal dystrophies,IRDs)是一类由基因缺陷引起的、进行性、不可逆的致盲性眼病,具有高度的临床和遗传异质性。本研究将目标区域捕获芯片结合高通量测序相结合,对19例IRDs患者进行致病基因的检测和一系列验证,详细分析了临床表现,探讨了临床表现和致病突变的关系。方法:1.临床研究方法:眼科相关检查,包括详细询问病史、家族史、最佳矫正视力(best-corrected visual acuity,BCVA)、眼前节裂隙灯检查、间接眼底镜及眼底照相、频域相干光断层扫描(optical coherence tomography,OCT)、视网膜电流图(electroretinogram,ERG)、视野检查等。2.分子遗传学研究方法:1)取患者和相关家庭成员外周血5ml,提取全基因组DNA,于-20℃保存;2)以美国Roche公司的2.1M NimbleGen序列捕获芯片为基础,选择205个视网膜疾病进行高通量测序;4)对测序结果进行分析,Sanger直接测序再次验证;5)利用在线软件对突变进行致病性评估。结果:19例IRDs患者DNA的NGS数据经分析滤过、Sanger直接测序验证和致病性评估后,有9例患者明确了致病突变,其中10个为新突变,3个为已知突变。这10个新突变中,8个为错义突变,2个为严重的移码突变。此外,我们发现了首例EYS基因与无色素沉着的视网膜相关基因以及15个候选基因制作特定的目标区域捕获芯片;3)将各患者的DNA色素变性相关的病例和INPP5E与视锥视杆细胞营养不良相关的病例。结论:本项研究对IRDs患者的DNA经过NGS测序后发现了多个新的致病突变,证实了目标区域捕获结合二代测序技术能够经济高效的检测具有高度异质性的IRDs病例,更好的解释了疾病致病基因与表型的关系,更有助于临床诊断和疾病评估。