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自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是植物在长期进化过程中形成的一种特殊生殖机制,它能够促进异花授粉抑制自花授粉从而保持高度杂合性,是植物遗传变异的重要保证。芸薹属植物自交不亲和性在遗传上受单基因S位点(S-locus)上的复等位基因控制,花粉雄性决定因子SCR(S-locus cysteine-rich protein)与柱头雌性决定因子SRK(S-locus protein kinase)发生特异性识别,将胞外信号传递至SRK胞内激酶域,使得SRK激酶域解除THLI/THL2的抑制作用而发生磷酸化,进而引发ARC1(arm repeat containing 1)的磷酸化和细胞质定位,活化的ARC1与胞质内靶蛋白Exo70A1结合,在泛素激活酶E1与泛素结合酶E2的共同协助下,Exo70A1经26S“泛素化—蛋白酶体途径”发生降解,最终导致自花花粉的萌发受阻或花粉管的生长受到抑制。本研究利用酵母双杂交系统及GST pull-down技术研究甘蓝自交不亲和反应中臂重复蛋白ARC1与Exo70A1间的相互作用。对11种甘蓝材料的ARC1及Exo70A1基因进行克隆测序,并对序列进行生物信息学分析,找出ARC1及Exo70A1的重要结构域。以典型自交不亲和结球甘蓝E1为材料,利用PCR扩增、定点突变和同源重组等技术构建ARC1与Exo70A1的短截片段或突变体群;然后运用酵母双杂交技术研究不同ARC1片段及突变体与Exo70A1片段间的相互作用,并应用GST pull-down技术进行体外相互作用检测,从而推导出ARC1与Exo70A1蛋白相互作用的识别模体(motifs),且对两者互作区段进行聚类分析。研究结果对阐明芸薹属植物自交不亲和信号转导的机理具有重要的意义。主要结果如下:1.序列的克隆分析序列比对显示11种甘蓝材料中ARC1序列一致性达到98.75%,仅存在41个氨基酸残基的差异,其中多态位点主要分布在ARC1的N端,而U-box结构域在甘蓝种内保持较高的保守性,整个臂重复区在11种材料中出现的序列分化较为一致。11条Exo70A1序列仅有24个氨基酸残基的差异,其序列一致性达到99.44%,说明exo70a1蛋白在甘蓝中高度保守,且保守程度高于arc1。exo70a1的n端(1-85aa)仅有一个差异位点,在第38aa处存在差异。2.特异性引物pcr所产生的缩短和突变的变异体群将arc1分为arc1210(1-210aa,包含亮氨酸拉链结构域)、arc1246(1-246aa,包含亮氨酸拉链和卷曲螺旋结构域)、arc1279(1-279aa,包含und结构域)及arc1354(1-354aa,包含und及u-box结构域)四个短截片段,利用特异性引物进行pcr扩增,扩增产物电泳检测所得条带大小分别为630bp,738bp,837bp,1062bp。运用重叠延伸pcr法,将arc1的272-277位氨基酸全部突变为ala,获得arc1354m(1-354aa,突变272-277aa)和arc1m(1-664aa,突变272-277aa)2个突变体,pcr扩增产物电泳检测条带大小分别为为1062bp和1992bp。利用特异性引物组合分别扩增exo70a185(1-85aa)及exo70a1(1-638aa)的编码序列,pcr扩增产物经电泳检测,条带大小分别为255bp和1919bp。3.arc1-exo70a1相互作用的酵母双杂交检测分析构建酵母重组载体pgadt7-arc1210、pgadt7-arc1246、pgadt7-arc1279、pgadt7-arc1354、pgadt7-arc1354m、pgadt7-arc1m、pgbkt7-exo70a185和pgbkt7-exo70a1。毒性及自激活检测实验说明重组质粒对酵母没有毒性,且目标基因在酵母中无自激活作用。相互作用检测表明,arc1的1-210aa和1-246aa区段与exo70a1的1-85aa和1-638aa区段均有较强的相互作用,arc1的1-279aa区段和1-354aa区段与exo70a1的1-85aa和1-638aa区段的相互作用较弱,而arc1的1-354aa区段(突变272-277aa)和1-664aa区段(突变272-277aa)与exo70a185和exo70a1之间的相互作用出现不稳定性,且总体偏弱。这些强弱变化说明arc1与exo70a1相互作用的识别模体可能位于arc1的n端和exo70a1的n端。4.arc1n端与exo70a1n端相互作用的gstpull-down体外验证构建重组表达载体pgex-4t-1-arc1210、pgex-4t-1-arc1246、pet-15b-exo70a185和pet-15b-exo70a1。在不同温度梯度及iptg浓度下原核诱导表达蛋白质,结果表明,32℃、0.8mmol/liptg浓度诱导4h时,pgex-4t-1-arc1210、pgex-4t-1-arc1246及pet-15b-exo70a1蛋白质表达丰度高,蛋白质大小分别为52kd、55kd和72kd;16℃、0.8mmol/liptg浓度过夜诱导,pet-15b-exo70a185蛋白质表达丰度高,蛋白质大小为10kd。利用beaverbeadstmgsh和beaverbeadstmida-nickel纯化蛋白质并进行gstpull-down体外相互作用验证,结果表明体外表达的arc1210、arc1246和exo70a185、exo70a1蛋白质之间存在相互作用。5.arc1-exo70a1互作模体的确定及分析酵母双杂交和GST pull-down结果表明,ARC1-Exo70A1相互作用的识别模体位于ARC1的1-210aa区段和Exo70A1的1-85aa区段,将ARC1210和Exo70A185序列经NCBI同源比对,共获得18条ARC1序列和23条Exo70A1序列,运用MEGA5.10进行聚类分析,结果表明ARC1与Exo70A1蛋白在进化过程中可能存在种系特异性,在不同物种间具有较高的保守性,且相互作用的蛋白质在同一物种的横向进化中存在协同进化。