VIGS实验体系优化及调控荔枝种胚发育和坐果关键基因的筛选和功能鉴定

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:menglimengwaiszy
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荔枝以其甜美的风味和丰富的营养驰名中外,深受人们的喜爱。荔枝种胚的败育即“焦核”是荔枝果实发育过程中常见的一种遗传现象。种胚的发育状况不仅和坐果率有密切的关系,而且直接影响果实的食用和加工品质。焦核果可食率高,口感也较大核果好。然而,种胚败育的内在分子机制有待深入的研究。本课题组前期研究发现细胞壁酸性转化酶活性低是‘糯米糍’荔枝种胚败育的主要原因,并筛选出了LcCWAI2、LcCWAI5两个细胞壁酸性转化酶基因和一个细胞壁酸性转化酶抑制子基因(LcCIF)基因可能与细胞壁酸性转化酶活性低有关,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术确定了LcCWAI5在荔枝种胚发育中关键作用,为荔枝基因功能验证研究打开了新的视角,然而适用于荔枝果实的VIGS实验体系有待进一步优化,其余两个基因的功能也有待进一步验证。前人的研究结果表明AP2/ERF对种子发育和糖组分也有明显的影响。本论文在前人基础上,进一步优化了适用于荔枝果实基因功能验证的病毒诱导的基因沉默技术,同时利用该实验体系对LcCWAI2和LcCIF在种胚发育上的功能进行了验证,探讨了AP2/ERF基因对荔枝坐果和果实发育的影响,利用转录组测序对影响荔枝坐果和果实发育的关键的AP2/ERF成员进行了筛选,获得了如下主要研究结果:1.烟草脆裂病毒(TRV)是适用于荔枝的效率较高和持久性较好的病毒载体,能够有效介导基因沉默,浸花侵染最佳的农杆菌浓度是OD600=1.0,最佳的处理时期是雌花盛花期,花前3-5天处理也有一定的效果,花后处理则效果不明显。2.花期和花后28天LcCWAI5沉默均可显著提高大核和部分焦核荔枝品种的败育率,减少种子的大小,而LcCWAI2则仅能在一定程度上减小种子的重量,对焦核率的影响不明显,花后35天处理的效果优于果实发育早期处理,说明LcCWAI5是荔枝种胚发育的关键基因,主要在种胚发育的早期起作用,而LcCWAI2可能主要影响种胚发育中后期干物质的积累。3.‘糯米糍’荔枝果实的LcCIF表达明显高于大核的‘黑叶’,LcCIF沉默后‘糯米糍’的种胚发育明显好于对照,并降低了焦核率,说明‘LcCIF’是‘糯米糍’种胚发育的负调控基因,此外,不同品种荔枝种柄的细胞壁酸性转化酶活性与LcCIF的表达呈显著的负相关,这些结果说明‘糯米糍’荔枝酸性转化酶活性低的主要原因可能是由于酸性转化酶抑制子的转录后调控。4.花后一周小果的转录组测序结果发现大核的荔枝品种‘黑叶’LcCWAI5的表达明显高于败育品种‘糯米糍’,两个品种该基因的启动子序列也有显著的差异,启动子序列的差异与其转录水平的具体关系有待进一步验证。5.利用VIGS实验体系进行AP2/ERF沉默可明显提高坐果率,增大果实,降低假种皮的己糖/蔗糖比率,但对种胚发育和假种皮的总体含量影响不大,利用RNA-Seq技术筛选获得了7个可能与荔枝果实发育相关的AP2/ERF基因,运用生物信息学手段进行初步的功能结构位点和理化特性分析。
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