论文部分内容阅读
青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染寄主植株的维管束,导致青枯病的发生,进而造成植株的死亡,俗称“植物瘟病”,是全球热带和亚热带地区的重要植物病害,青枯菌可以侵染54个科的数百种植物。到目前为止还没有一种能够有效防治青枯病的农业措施、物理措施或者化学措施,因此生物防治日益受到人们的重视。本研究分为三个部分:1、青枯菌GMI1000菌株的eGFP标记;2、青枯拮抗菌的筛选鉴定和温室接种实验;3、拮抗菌GZ-34活性物质的提取分离鉴定和发酵条件优化,拮抗菌GZ-34对黑粉菌和稻瘟菌的抑制作用。主要研究结果如下:1、构建PBBR1-2-eGFP质粒,转入青枯菌,获得eGFP标记的青枯菌菌株。2、从广东广州、河南永城、湖南永州等30地共采集土样30份,采用土壤稀释悬浮液分离法,涂布LB平板,挑取单菌落,在青枯菌平板上通过对峙生长筛选得到384株有明显拮抗效果的菌株,然后对初筛的拮抗菌摇菌发酵进行复筛,得到有稳定拮抗效果的菌株56株。3、对筛选得到的拮抗菌菌株进行鉴定,结果为:菌株GZ-27为单不动杆菌(Acinetobacter soli),保藏编号为CCTCC NO:M 2016351;菌株GZ-33为泛菌(Pantoea coffeiphila),保藏编号为CCTCC NO:M 2016352;菌株GZ-34为大肠埃希氏菌(Escherichia coli),保藏编号为CCTCC NO:M 2016353;菌株GZ-39为达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii),保藏编号为CCTCC NO:M 2016354,以上菌株都保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。4、对菌株GZ-27,33,34,39进行温室接种番茄苗实验,采用灌根法接种,以上4种拮抗菌均有良好的防治效果。5、对拮抗菌菌株GZ-34的抑菌物质进行提取分离纯化和鉴定。经过发酵萃取得到粗提液,检测其抑菌活性。结果显示,粗提物对青枯菌有很高的抑菌活性,同时粗提物能抑制甘蔗鞭黑粉菌生长和有性配合。然后对抑菌物质进行分离和鉴定,通过凝胶柱分离纯化,HPLC分离纯化,ESI-MS和NMR鉴定等步骤,鉴定其对青枯菌的抑菌物质有两种cyclo-((S)-pro-(R)-Ile)和cyclo-((S)-pro-(S)-phe),同时抑菌物质cyclo-((S)-pro-(S)-phe)还能抑制稻瘟菌孢子的形成。6、cyclo-((S)-pro-(R)-Ile)和cyclo-((S)-pro-(S)-phe)两种抑菌物质对青枯菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)分别为224μg/mL和226μg/mL。7、两种抑菌物质对青枯菌的毒力基因表达的影响,如胞外多糖、运动性、三型分泌系统、TTE,四型分泌系统、纤维素酶、趋化性和调控因子PhcA等,抑菌物质浓度为100μM,选择抑菌物质的浓度为100μM,是因为在这个浓度下抑菌物质不影响青枯菌的生长。