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本论文以高静水压处理水稻种子,从高静水压处理后的水稻种胚基因组DNA的完整性和基因表达模式的变化、处理后代中出现的突变类型和突变率等方面进行了研究,试图探明高静水压对水稻诱变的分子机理。主要研究结果如下:
1.高静水压对水稻突变的影响
高静水压处理后,不同水稻品种在M2代群体中出现的突变率和突变类型不同,粤丰占高压M2代群体中出现的突变类型较少,且突变率较低;测64及其转基因水稻测64B高压M2代群体中出现的突变类型和突变率相近,且均高于粤丰占;同一品种随着浸种时间的延长和处理压力的增大,高压M2代中出现的突变类型和突变率均增加,但保压时间的变化对突变类型和突变率的影响不明显。
2.高静水压对水稻种胚DNA链的完整性和DNA修复基因表达模式的影响
彗星实验的研究结果表明,高静水压处理能造成水稻种胚DNA链的断裂损伤,且随着处理压力的增大,DNA链的断裂损伤程度加大;100 MPa高静水压引起的DNA链的断裂损伤绝大部分能在处理后的8h内得到修复,但仍有部分损伤在处理后的40 h内不能得到完全的修复。半定量RT-PCR的研究结果显示,高压处理能诱导结构特异性核酸酶基因OsFEN-1a和解旋酶基因OsRecQ1的表达,同时抑制DNA聚合酶基因OsPolλ和DNA复制后修复基因OsRad6的表达。从以上研究结果推测,高静水压处理引起的水稻种胚DNA链断裂损伤的不完全修复和DNA修复系统的破坏是可能诱发水稻基因突变的重要原因。
3.高静水压对水稻种子基因表达影响
采用抑制差减杂交(SSH)结合镜像选择(MOS)技术构建了在高静水压处理后萌发期的水稻种子的正、反向差减cDNA文库,并通过反向Northern点杂交验证和测序分析,获得了45个差异表达的基因序列,这些受高静水压诱导或抑制表达的基因涉及到代谢、胁迫响应、转录调节、转运调控及信号传导等方面。其中Cu/Zn SOD、CCH等基因的在高静水压后的诱导表达表明水稻种胚中发生了活性氧的积累和氧化损伤事件,这可能是水稻种胚DNA链断裂产生的重要原因;对这些差异表达的基因进行生物信息学分析的结果表明,这些基因广泛的分布在水稻的各条染色体上,同时预测这些基因编码的蛋白质广泛的定位于细胞质、叶绿体、胞外、微体、线粒体和细胞核中。
4.受高压诱导表达的水稻未知功能基因OsTRF4的生物信息学及表达分析
对受高压诱导的未知功能的基因OsTRF4的生物信息学分析结果显示,该基因序列中含有一个TRF4结构域(与DNA复制、重组和修复相关),编码的蛋白主要位于细胞核中;半定量RT-PCR表达分析结果显示,该基因在萌发期的水稻种子中大量表达,在两叶一心期的水稻根中也表达,但在同期的叶鞘和叶片中表达很低:高压、低温和高温均能诱导OsTRF4基因的表达,盐和甘露醇均不能诱导其表达:激素SA、JA、GA、ABA和IAA均能促进两叶一心期幼苗叶片中OsTRF4基因的表达。本研究为进一步验证该基因的功能和探索高静水压处理引起的水稻种胚DNA损伤的修复途径打下了基础。