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目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是一种多能干细胞,能在特定条件下分化成多种终末细胞,且具有易获取、多向分化、优异的再生能力等特点,目前广泛应用于移植和组织再生。大量的研究也表明,干细胞移植后能保护急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)的心脏。但是,同种异体干细胞移植后,宿主对移植物的免疫排斥反应仍然不可避免。引起免疫排斥反应的主要原因是主要组织相容性复合物(Major Histocompability Complex,MHC)激活T淋巴细胞产生特异性免疫反应。相关研究发现,在同种异体BMSCs移植治疗AMI的大鼠模型中,干细胞移植后3月至6月内MHC-Ⅱ表达上升,而MHC-Ⅰb的表达降低,这种干细胞表面免疫原性抗原的变化使受体对移植物产生免疫排斥反应,最终导致BMSCs不能在受体体内长期存活。因此,本实验旨在探讨:1、BMSCs同种异体移植后参与免疫排斥反应;2、BMSCs定向分化多种终末细胞后,MHC-Ⅰb基因群各亚型表达变化。方法:1、复苏、培养BMSCs,当细胞融合至80%-90%时,用0.25%胰酶进行消化,细胞计数后传代、铺板,为后续实验做准备。2、体内实验分为3组:假手术组(Sham)、单纯心梗组(AMI)、干细胞移植组(BMSCs)。结扎大鼠冠状动脉前降支,构建大鼠心梗模型,造模1周后在心梗边缘区多点注射心肌移植BMSCs。3、干细胞移植后4周,心脏彩超评估大鼠心功能,后取各组心脏心梗组织,用免疫荧光方法,检测CD8分子的表达变化。4、以50ng/ml VEGF+10ng/ml b FGF联合诱导BMSCs定向分化成血管内皮样细胞,分别在诱导2周、3周、4周时光镜下观察细胞形态变化,同时通过RT-PCR检测KDR、ICAM-1、v WF等血管内皮相关基因和用Western Blotting检测ICAM-1、v WF蛋白表达变化,评估定向分化效果。同时用RT-PCR、琼脂糖电泳检测MHC-Ⅰb(RT1-S3、RT1-E、RT1-E2)基因表达变化。5、以10ummol/L 5-aza诱导BMSCs定向分化成心肌样细胞2周、3周,光镜下观察细胞形态变化,用RT-PCR检测GATA4、MHC、c Tn I心肌相关基因及Western Blotting检测MHC、c Tn I蛋白表达鉴定分化效果。同时用RT-PCR检测MHC-Ⅰb(RT1-S3、RT1-E、RT1-E2)基因表达变化。6、以抗坏血酸、β-甘油酸钠、地塞米松联和诱导BMSCs定向分化成骨细胞2周,光镜下观察细胞形态变化,茜红染色鉴定成骨分化情况。同时用RT-PCR检测MHC-Ⅰb(RT1-S3、RT1-E、RT1-E2)基因表达变化。结果:1、复苏细胞后,BMSCs成“S”型生长,光镜下BMSCs呈梭形、纺锤体形、三角形。随着培养时间延长及传代次数增加,细胞逐渐出现老化,细胞形态呈“破布”样改变。2、成功构建大鼠心肌梗死模型,结扎冠状动脉前降支后可见心梗区域变白,室壁运动减弱,并通过心肌注射的方法移植同种异体BMSCs。3、干细胞移植后4周后,各组大鼠心脏彩超提示:与单纯心梗组心功能相比,BMSCs移植组心功能明显改善。取心脏后可见心梗区域组织塌陷,组织增生,梗死区组织的免疫荧光结果显示,BMSC移植组CD8表达较AMI、Sham组明显升高(p<0.01)。4、经过VEGF+b FGF诱导后,BMSCs逐渐出现形态上的改变,光镜下可见诱导后细胞体积变小,逐渐呈短梭形、椭圆形、圆形变化,形态饱满,立体感增强。诱导3周后部分细胞呈现内皮细胞的“岛状样”或“铺路石样”典型改变。随着诱导时间延长,可见更多由原来长梭形变成类圆形,“铺路石样”细胞更加典型。RT-PCR检测诱导分化后2、3、4周KDR、ICAM-1基因表达,结果显示:随诊诱导时间的延长KDR、ICAM-1基因表达呈进行性升高(p<0.05),同时通过Western Blotting方法检测诱导组ICAM-1同样随诱导时间延长呈进行性增长(p<0.01)。但v WF基因m RNA及蛋白在3周前随诱导时间延长而升高,而3周后开始出现下降(p<0.01)。5、经过VEGF+b FGF诱导2、3、4周后,RT-PCR检测MHC-Ⅰb基因,RT1-S3诱导1周后轻微升高1.32倍(p>0.05),无统计学意义。随后随着诱导时间延长,其表达量呈进行性下降(p<0.01),而RT1-E、RT1-E2基因表达量呈进行性升高(p<0.05)。随后琼脂糖电泳后,条带大小同样符合引物设计大小。6、5-aza诱导2周、3周后,细胞形态学上出现明显改变,细胞形态各异,不规则形细胞增多,同时体积开始变大,异质性改变,细胞聚集贴壁与相邻细胞完全接触,排列方向一致,同时出现“肌岛”聚集,但未见典型肌管样结构,更无自发性心肌搏动。RT-PCR检测GATA4、MHC、c Tn I表达,诱导2周时,GATA4表达升高至峰值,为未诱导组的7.14倍(p<0.01)。但2周后,GATA4表达较前下降,3周后为未诱导组的2.68倍(p<0.05)。而MHC、c Tn I则随着诱导时间变化呈进行性升高(p<0.01)。通过Western Blotting方法检测,MHC的表达量随着诱导时间延长,呈进行性升高趋势(p<0.01),但未见c Tn I蛋白表达。7、5-aza诱导2周、3周后,RT-PCR检测MHC-Ⅰb基因,RT1-S3随着诱导时间延长,其表达量呈进行性下降(p<0.001)。RT1-E在诱导后2周后出现短暂性下降,为未诱导组的0.52倍(p>0.05),无统计学意义。于第3周,RT1-E基因表达则升高,为未诱导组的2.87倍(p<0.05)。RT1-E2基因表达则随着诱导时间延长,而呈现逐渐升高(p<0.05)。8、成骨诱导剂诱导BMSCs诱导2周后,光镜下观察可见骨结节,钙结节。茜红染色后可见钙结节沉积。RT-PCR检测MHC-Ⅰb基因,与对照组相比,诱导组RT1-S3、E、E2表达上升(p<0.05)。结论:1、MHC-Ⅰ参与BMSCs同种异体移植后免疫排斥反应。2、BMSCs定向分化后MHC-Ⅰb基因群呈不同变化,其中RT1-S3亚型表达下降可能是产生移植排斥的原因之一。