【摘 要】
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核糖核酸(RNA)的提取是核酸检测流程的重要步骤,RNA提取时间对核酸检测流程的效率具有很大影响。当前的RNA提取方法时间长、操作复杂、提取过程中容易造成RNA的降解,很大程度上限制了核酸检测的效率。因此亟待研究一种快速、有效的RNA提取新技术,加快核酸检测中的样本前处理时间,从而提升核酸检测效率。甲酰胺具有保护RNA免受降解的作用,并且能将RNA从样本中分离;壳聚糖在p H<6.3时显正电性,可
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核糖核酸(RNA)的提取是核酸检测流程的重要步骤,RNA提取时间对核酸检测流程的效率具有很大影响。当前的RNA提取方法时间长、操作复杂、提取过程中容易造成RNA的降解,很大程度上限制了核酸检测的效率。因此亟待研究一种快速、有效的RNA提取新技术,加快核酸检测中的样本前处理时间,从而提升核酸检测效率。甲酰胺具有保护RNA免受降解的作用,并且能将RNA从样本中分离;壳聚糖在p H<6.3时显正电性,可通过静电吸附与显负电性的RNA结合实现RNA的纯化。因此,本文首次提出一种基于甲酰胺分离和壳聚糖-二氧化硅膜纯化的食源性致病菌RNA快速提取方法——FBS/chitosan。以食源性致病菌大肠杆菌为研究对象,使用甲酰胺裂解液分离大肠杆菌中的RNA,再通过壳聚糖修饰的二氧化硅膜将RNA进行纯化,该方案可在15 min内完成大肠杆菌中总RNA的提取。与TRIzol法和商业试剂盒相比,提取过程更简单、快速,并且成本更低,有一定的发展潜力,有望成为需求量日益增加的核酸检测方法的样本快速制备工具。基于固定化的核酸捕获探针与靶标杂交,特异性捕获靶标的核酸提取方法目前得到了一定的应用。但核酸被动杂交过程一般需要2 h,时间较长,而施加一定的电场强度可以加速核酸移动,从而加速杂交。因此,本文首次将电场辅助加速杂交用于mi RNA的快速分离,提出一种超快速的mi RNA提取方案。通过施加+0.5V/-0.2V的交替电场,促进mi RNA与捕获探针加速杂交。再通过-1V负电场将捕获探针与靶标mi RNA的杂交体从电极分离洗脱。整个过程仅需150 s即可完成样本中mi RNA的分离。结果表明,该方法对低丰度的mi RNA具有很高的回收效率,并能用于血清样本中的mi RNA提取,为mi RNA的超快速检测提供了可行的样本前处理方案,对疾病快速诊断具有重要研究意义。
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