研究背景:　　 慢性炎性疼痛由于其发病机制复杂目前并无理想的治疗靶点，但近年的大量的研究结果表明中枢系统的突触可塑性是慢性疼痛产生痛觉敏化的基础。突触可塑性的形成和维持主要依赖于突触前的神经递质释放，神经递质在突触间隙的传递以及神经递质与突触后神经元受体结合的过程。因此调控突触前的突触囊泡神经递质持续的释放是调控突触可塑性形成的关键因素，这可能成为治疗慢性炎性疼痛的治疗靶点。　　 细胞周期素性依赖蛋白激酶-5(cyclin-dependent kinase-5，Cdk5)属于丝氨酸和酸酸家族，其主要分布在后有丝分裂神经元。在后有丝分裂神经元Cdk5酶的活性主被激活子p35或者p39激活。p35和p39钙蛋白酶(calpain)作用下裂解为p25和p29。既往的研究结果表明Cdk5在调控神经元的生长发育和迁移具有重要的作用。但近期的试验数据揭示Cdk5在调控炎性疼痛的热痛觉敏化具有重要作用调控作用而对机械痛则影响。在小鼠足底注射辣椒素(capsaicin)后，小鼠背根神经节的Cdk5被激活并通过磷酸化的背根神经节的辣椒素受体调控capsaicin足底注射致的热痛觉敏化。而大鼠足底注射完全弗氏佐剂(Complete Freunds adjuvant，CFA)导致脊髓后角的Cdk5酶的活性增高，给与Cdk5抑制剂Roscovitine可以明显的抑制完全弗氏佐剂导致的热痛觉敏化。尽管如此，Cdk5调控炎性疼痛的机制目前仍不清楚，有研究结果表明海马中枢突触前的Cdk5成为调控神经递质释放的主控点。众所周知N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体复合体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)是突触囊泡释神经递质的中心和靶控点而突触体(synaptophysin)是SNARE形成的关键因素。近期的研究结果表明在海马皮层CA1区基因敲除Cdk5导致突触体素蛋白表达明显下降。在慢性坐骨神经缩窄性损伤(chronic constriction injury，CCI)模型中，大鼠脊髓后角的synaptophysin蛋白表达与CCI所致的热痛阈变化呈明显的线性相关。　　 基于已有的研究结果，我们提出如下假设:在脊髓水平上Cdk5调控炎性疼痛可能通过调控synaptohysin的功能调节调控炎性疼痛。这可能成为Cdk5调控炎性疼痛的机制之一。　　 试验方法:　　 1.炎性疼痛模型的建立: SD雄性大鼠(200-250g)分为试验组和对照组。实验组大鼠左后足底注射完全弗氏佐剂100μL，右足底注射生理盐水100μL作为对照(n=6)，对照组的大鼠左后足底和右后足底分别注射生理盐水100μL作为对照(n=6)。　　 2.大鼠鞘内置管:为了给与大鼠脊髓鞘内注射药物，按照Yaksh改良法给与不同组的大鼠脊髓鞘内置管。　　 3.大鼠伤害性行为学的观察:　　 3.1.试验组和对照组的大鼠分别放置在单个观察箱内测试热缩脚潜伏期的阈值。　　 3.2.Cdk5选择性抑制Roscovitine100μg和等容量的DMSO分别给与大鼠脊髓鞘内注射，然后两组大鼠分别给与热辐射刺激后观察它们的热缩脚潜伏期的阈值(n=6/group)。　　 4.分子生物学试验:　　 4.1.免疫共定位:SD大鼠共6组(n=3/group)。大鼠在组织灌注后取同侧的脊髓后角在经过免疫荧光组织化学的步骤处理后。通过共聚显微镜观察Cdk5与p35，synaptophysin， SNAP-25和sytaxion1A共定位的关系。　　 4.2.Western blot试验:在行为学测试后取不同组别大鼠脊髓后角蛋白定量后通过Western blot的方法检测各组的synaptophysin，p35和p25蛋白的变化。　　 4.3.Cdk5酶的活性的分析:通过免疫沉淀的方法后通过Western blot检测Cdk5酶的底物HistoneH1底物磷酸化的水平，HistoneH1为内参对照。　　 4.结果:　　 1.Cdk5与p35，synaptophysin，SNAP-25和sytaxion1A在大鼠同侧的脊髓后角神经元完全共定位。　　 2.大鼠足底CFA注射导致大鼠的热缩脚潜伏期阈值与对照组比明显下降，其下降的阈值在第6小时和24小时最为显著，在第3天开始升高并到达平台期后一直持续到第5天（**p＜0.01）。大鼠脊髓鞘内注射Roscovitine100μg与鞘内注射DMSO相比显著地提高CFA足底注射所致的下降的热缩脚潜伏期的阈值（**p＜0.01）。大鼠脊髓鞘内注射Roscovitine对足底注射生理盐水的大鼠的同侧和对侧的热缩脚潜伏期阈值没有显著的影响(p＞0.05)。　　 3.Synaptophysin蛋白的表达与对照组比较从CFA足底注射6小时一直到第3天明显增加（*p＜0.05，**p＜0.01）。在大鼠足底注射CFA第5天synaptiphysin表达回到对照组的基线附近。Synaptophysin不同时间点的蛋白表达与CFA足底注射后大鼠的热缩脚潜伏期阈值的变化呈明显的线性相关（**p＜0.001）。鞘内注射Roscovitine100μg明显的抑制大鼠脊髓后角synaptophysin的蛋白高表达（*p＜0.05，*p＜0.01），这表明Cdk5选择性抑制剂可以明显地抑制synaptophysin的蛋白表达。　　 4.钙调蛋白酶(calpain)在CFA足底注射6h与对照组相比显著增高（*p＜0.05），而在第1d，3d则没有明显的变化(p＞0.05)。　　 5.Cdk5酶的活性在CFA足底注射后从6小时一直到第5天，Cdk5酶的活性与对照组相比明显的增加（*p＜0.05，**p＜0.01）。Roscovitine100μg提前于CFA足底注射30分钟进行脊髓鞘内注射后1天明显地抑制Cdk5酶的活性（*p＜0.05）。同时在1天的时间点p25表达增加而p35的表达与则没有明显的变化。大鼠脊髓鞘内注射Roscovitine100μg显著的抑制P25的蛋白地表达（**p＜0.01），而对p35的蛋白表达则没有明显的影响(p＞0.05)。Cdk5酶的活性表达与大鼠的热缩脚潜伏期阈值和synaptophysin的蛋白的表达呈明显的线性相关（**p＜0.01）。　　 结论：　　 Synaptophysin参与了大鼠CFA足底注射所致的热痛觉敏化的形成。Cdk5可能通过调控突前的synaptophysin功能调控CFA足底注射所致的炎性疼痛。因此阻断Cdk5/synaptophysin的异常激活可能成为治疗炎性疼痛一个新的治疗靶点。