前言:　　 甘草甜素(G1ycyrrhizin,GL)是甘草中三萜皂甙的主要成分,具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗变态反应、抗肿瘤等作用,国内外的研究已证明它对机体免疫系统功能产生一定的调节作用。甘草甜素具有广泛药理作用,其免疫调节作用表现在对免疫活性细胞、细胞因子、补体等的促进作用。故临床上已广泛应用于急性、慢性肝炎、湿疹、荨麻疹及过敏性皮肤病、药物疹和嗜酸性粒细胞增多症以及AIDS等疾病的治疗。　　 自然杀伤细胞(naturalkiller,NK)来源于骨髓淋巴样干细胞,主要分布于外周血和脾脏。NK细胞不表达特异性抗原识别受体,是不同于T,B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。NK细胞无需特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞杀伤靶细胞主要是通过与靶细胞直接接触,分泌杀伤介质穿孔素、颗粒酶、TNF和NK细胞毒因子(LT)等导致靶细胞死亡。另一方面,NK细胞还可通过分泌IFN-γ、INF-α、GM-CSF、LT、IL-8和IL-5等有免疫调节作用的细胞因子途径来间接杀伤靶细胞。　　 目前,已有一些研究表明GL对机体免疫功能具有调节作用,但其作用机制尚不十分清楚。鉴于甘草甜素和NK细胞在免疫系统中的重要地位,本研究以NK-92MI细胞株为研究体系,首先研究了GL对NK-92MI细胞增殖活性和杀伤活性等功能的影响,并分析了杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的释放与GL增强NK92-MI细胞杀伤活性的关系;其次研究了IFN-γ的释放及IFN-γ和IP-10的tuRNA的表达,以揭示GL对NK细胞生物学活性调控作用的机制;最后研究了GL对NK92-MI细胞活化性受体NCRs表达的影响,以及活化性受体与抑制性受体的之间的平衡,进一步阐明GL对NK-92MI细胞功能的调控作用及内在作用机制。　　 材料和方法:　　 1.细胞培养　　 NK细胞株:NK一92MI细胞株为非IL-2依赖性NK-92MI细胞株(NK-92MI细胞来自一个进行性非霍奇金淋巴瘤患者,1998年建系),购自中科院上海细胞库;用含12.5%胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基(不含RNA和DNA)传代培养。　　 K562细胞株:K562细胞用含12.5%胎牛血清的1640培养基(不含RNA和DNA)传代培养。　　 2.CCK-8法测定GL对NK-92MI细胞增殖活性的影响。　　 3.CCK-8法测定GL对NK-92MI细胞杀伤活性的影响。　　 4.Western-Blot法测定GL对NK-92MI细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)蛋白表达的影响。　　 5.ELISA法测定GL对NK-92MI细胞分泌IFN-Y量的影响。　　 6.Real-TimePCR法测定GL对NK-92MI细胞IP-10和IFN-γmRNA表达的影响。　　 7.Real-TimePCR法测定NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)mRNA表达的影响。　　 8.流式细胞术检测传递抑制信号和活化信号的重要受体(NKG2A/NKG2D)膜表达的影响。　　 9.统计学分析　　 所得实验数据均以均数±标准差(x±SD)表示,各组间均数比较采用一维方差分析(one-wayANOVA),p＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果:　　 一、GL对NK-92MI细胞增殖作用的影响　　 一定浓度(25μg/ml～0.39μg/m1)的GL作用24h后,6.25μg/ml～0.39μg/ml的GL对NK-92MI细胞的增殖有明显促进作用,而25μg/ml的GL对NK92-MI细胞有明显的抑制作用。　　 二、GL对NK-92MI细胞杀伤活性的影响　　 一定浓度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用24h后,各浓度GL对NK-92MI细胞的杀伤活性均显示有明显增强作用。　　 三、GL对NK-92MI细胞穿孔素和颗粒酶B蛋白表达的影响　　 选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI细胞24h,0.39μg/ml～0.78μg/mlGL可明显增加HNK-92MI细胞穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达,6.25μg/ml～25μg/mlGL可明显抑制NK-92MI细胞穿孔素的蛋白表达。　　 四、GL对NK-92MI细胞IFN-γ释放量的影响　　 选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI细胞72h,结果显示在浓度为6.25μg/ml～0.39μg/ml的GL作用下NK细胞对IFN-γ的释放明显增加,而当浓度为25μg/ml的GL则可明显抑制IFN-γ的释放。　　 五、GL对NK-92MI细胞IP-10和IFN-γmRNA表达的影响　　 选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI细胞12h,结果显示在浓度为0.78μg/ml的GL作用下IP-10和IFN-γmRNA表达明显增加。　　 六、GL对NK-92MI细胞活化性受体NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)mRNA表达的影响。　　 选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI细胞24h,结果证实当浓度为0.39μg/mlGL可显著增加NKp30,NKp44,NKp46mRNA的表达,浓度为0.78μg/ml～6.25μg/ml的GL显著抑制NKp30和NKp44mRNA的表达。　　 七、GL对NK92-MI细胞NKG2MG2D膜表达的影响　　 选择对杀伤活性增强作用较大的浓度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI细胞24h,结果显示在浓度为1.56μg/ml和0.78μg/ml的GL作用下NKG2A/NKG2D的膜表达明显增加。　　 结论:　　 1.一定浓度范围(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素对NK-92MI细胞的增殖活性有促进作用。　　 2.一定浓度范围(25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素对NK-92MI细胞杀伤活性有促进作用。　　 3.浓度为0.39μg/ml～10.78μg/ml的GL可增加NK-92MI细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的蛋白表达,说明GL对NK-92MI细胞杀伤活性的增强作用,是通过增加其杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的合成来实现的。　　 4.浓度为6.25μg/ml～0.39μg/ml的GL可诱导NK-92MI细胞中IFN-γ的释放增加,浓度为0.78μg/ml的GL可以明显上调NK-92MI细胞的IP-10和IFN-γmRNA的表达,说明GL是通过在局部上调IP-10mRNA的表达水平来激活具有IP-10受体的自然杀伤细胞,使自然杀伤细胞释放大量IFN-γ,进而发挥NK细胞的杀伤作用。　　 5.浓度为0.39μg/ml的GL可诱导NK-92MI细胞中NCRs(尤其是NKp46)mRNA的表达明显增加。浓度为1.56μg/ml和0.78μg/ml的GL可诱导NK-92MI细胞抑制受体NKG2A的膜表达增加,而对NK细胞活化性受体NKG2D的膜表达则起到抑制作用,提示GL作为一种活化因子调节NK-92MI细胞的杀伤功能是通过增加活化性受体NCRs的表达来实现的。