猪病毒性腹泻是当前养猪业常见的肠道性疫病,其主要病原包括猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virusof swine,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotarvirus,Po RV),其中,PEDV感染率和死亡率均最高。当前,猪病毒性腹泻防控技术主要以疫苗免疫为主,已有商品化疫苗但无统一标准,免疫原性差,仔猪发病率高。据相关文献报道,益生菌可作为绿色环保型添加剂,与核酸疫苗联合应用可增强其免疫效果,提高仔猪的生长性能、细胞免疫和黏膜免疫水平,促进免疫器官和小肠绒毛的发育。本试验筛选与贵州省流行毒株亲缘关系较近候选疫苗株,取妊娠母猪跟胎免疫方法,探讨复合益生菌对猪病毒性腹泻免疫效果的影响研究。具体研究内容如下:1.贵州省PEDV部分毒株分子流行病学研究:采集贵州某规模化猪场新生仔猪肠道内容物和粪便120份,通过RT-PCR扩增、序列测定获得PEDV S和M全基因序列,生物信息学分析结果显示:S基因核苷酸序列全长4 161bp,编码1 386个氨基酸,将该毒株命名为GZFQ11-2016;M基因核苷酸序列全长681 bp,编码226个氨基酸,将该毒株命名为GZFQ06-2017。S基因序列与参考毒株CV777和KH的同源性86.6%为最高,并处在系统发育树同一分支,M基因与Attenuated DR13、SC1402和SQ2014的同源性71.4%为最高,并处在系统发育树同一分支,与参考毒株CV777的同源性70.6%次之。GZFQ11-2016和GZFQ06-2017株与多个参考毒株相比发生了基因突变或变异,但与参考毒株CV777的同源性相对较高,说明参考毒株CV777可作为贵州省PEDV疫苗候选毒株。2.猪病毒性腹泻疫苗免疫抗体消长规律研究:筛选PEDV、TGEV和Po RV抗体和抗原为双阴性妊娠母猪100头,平均分为试验A、B、C、D组和对照组。其中,试验A组产前40 d首免和产前20 d二免均接种“PTR”三联弱毒疫苗(以下均简称“PTR”),试验B组产前40 d首免和产前20 d二免均接种“PT”二联灭活疫苗(以下均简称“PT”),试验C组产前40 d首免“PTR”和产前20 d二免“PT”,试验D组产前40 d首免“PT”和产前20 d二免“PTR”,对照组产前40 d和产前20 d均注射生理盐水。试验A、B、C和D组所产的仔猪随机选取20头,分为第一组、第二组、第三组和第四组,仔猪均28日龄首免和65日龄二免,免疫程序与母猪相同。对照组母猪所产仔猪随机选取60头分为3组,其中,第五组3日龄肌肉接种PTR和35日龄肌肉接种PTR、第六组1~3日龄滴鼻接种PTR和28日龄免疫PTR和对照组。母猪分娩后0 d~14 d采集乳汁利用ELISA方法检测PEDV SIg A抗体滴度;仔猪7日龄~80日龄采血并离心取上清,采用ELISA方法检测其PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗体滴度。结果显示:产前40 d和产前20 d只注射PT或PTR的猪群分娩后7~10 d乳汁中PEDV SIg A抗体滴度低于产前40 d和产前20 d注射PTR和PT分娩第14 d乳汁中PEDV SIg A抗体滴度。表明分别接种PTR和PT的效果优于免疫单一PTR或PT,所产仔猪3日龄滴鼻接种PTR,28日龄二次免疫PTR和65日龄三次免疫PT,15 d后抗体滴度处于上升动态。本实验中,试验C组临床效果最佳。3.益生菌对仔猪生长性能、细胞免疫及黏膜免疫水平的影响研究:将试验C组母猪所产仔猪在哺乳阶段随机选取120头,均分为试验组和对照组。仔猪21日龄断奶,哺乳阶段仔猪试验组猪群60头平均分为试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,分别在基础日粮中添加0.10%、0.20%、0.30%复合益生菌,哺乳阶段对照组猪群随机选取20头作为对照组(不含复合益生菌)。对不同阶段仔猪其生长性能、血液生理生化、血清细胞因子、肠道黏膜SIg A、免疫器官MC分泌及小肠绒毛发育等水平进行评估。结果显示:复合益生菌能显著提高哺乳仔猪的平均日增重(P<0.05),降低哺乳仔猪腹泻率(P<0.01);增加仔猪血液中白细胞、淋巴细胞、红细胞和血小板数量(P<0.05);血清乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)和总蛋白(TP)含量均高于对照组(P<0.01),谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和血清尿素氮(BUN)含量均高于对照组(P>0.05);增加IL-6、IL-1β和TNF-a分泌量(P<0.05);提高十二指肠、回肠和盲肠黏膜SIg A水平(P<0.05)和空肠黏膜SIg A水平分泌(P<0.01);免疫器官中MC分泌数量极显著高于对照组(P<0.01);十二指肠和回肠绒毛结构较对照组完整,排列整齐,但隐窝均值试验组极显著高于对照组(P<0.01),绒毛均值试验组显著高于对照组(P<0.05),试验组空场绒毛均值与隐窝均值均极显著高于对照组(P<0.01),但空肠和回肠绒毛隐窝比均值试验组极显著低于对照组(P<0.01),十二指肠试验组显著低于对照组(P<0.05)。早期断奶阶段中,试验Ⅱ、Ⅲ组末重极显著高于试验Ⅰ组和对照组(P<0.01);试验Ⅲ组平均日增重极显著高于试验Ⅰ、Ⅱ组及对照组(P<0.01),试验Ⅲ组平均日采食量显著高于试验Ⅰ、Ⅱ组及对照组(P<0.05),对照组、试验Ⅱ组腹泻率均极显著高于试验Ⅰ、Ⅲ组(P<0.01);试验组中的LDH、ALT和ALP含量均高于对照组,TP含量低于对照组,差异均不显著(P>0.05);试验组中BUN含量均显著高于对照组(P<0.05),试验Ⅱ、Ⅲ组AST含量显著高于试验Ⅰ组和对照组(P<0.05)。试验20 d,试验Ⅱ、Ⅲ组中IL-6水平极显著高于试验Ⅰ组及对照组(P<0.01),IL-1β和TNF-α水平与对照组相比差异不显著(P>0.05);试验40 d,试验组IL-1β水平均显著高于对照组(P>0.05),IL-6和TNF-a水平均极显著高于对照组(P<0.01)。试验组中空肠黏膜SIg A水平极显著高于对照组(P<0.01);十二指肠和回肠黏膜SIg A水平均显著高于对照组(P<0.05),盲肠黏膜SIg A水平低于对照组,差异不显著(P>0.05);腹股沟淋巴结MC分泌数量试验Ⅱ组高于试验Ⅰ组和试验Ⅲ组(P<0.01);胸腺MC分泌数量试验Ⅱ组高于试验Ⅰ组和试验Ⅲ组(P<0.01);脾脏MC分泌数量试验Ⅲ组高于试验Ⅰ组和试验Ⅱ组(P<0.01);十二指肠、空场和回肠绒毛均值试验Ⅱ、Ⅲ组极显著高于试验Ⅰ组和对照组(P<0.01);对隐窝均值来说,十二指肠和空肠试验Ⅱ组极显著高于试验Ⅰ、Ⅲ组和对照组(P<0.01),回肠试验Ⅰ组极显著高于试验Ⅱ、Ⅲ组和对照组(P<0.01)。说明复合益生菌可提高仔猪的生长性能、细胞和黏膜免疫水平,促进免疫器官和小肠发育。综上所述:成功克隆贵州省2株PEDV S和M基因,通过生物信息学分析说明贵州省近几年新流行毒株与参考毒株CV777亲缘关系最近,表明参考毒株CV777可作为当前贵州省疫苗选择候选毒株。妊娠母猪产前40 d和产前20 d分别注射PTR和PT免疫效果优于PTR或PT,所产仔猪3日龄滴鼻接种PTR,28日龄二次免疫PTR和65日龄三次免疫PT,此免疫程序中乳汁中PEDV SIg A抗体以及PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗体滴度维持时间较长,得出试验C组免疫效果最佳。筛选试验C组所产仔猪结合复合益生菌应用于哺乳阶段和断奶阶段仔猪,得出最佳复合益生菌添加比例为0.30%,可提高哺乳仔猪和早期断奶仔猪的生长性能,增强仔猪细胞免疫和黏膜免疫水平,有助于哺乳仔猪和早期断奶仔猪免疫器官MC分化和小肠绒毛的发育。