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河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种非蛋白类神经毒素，存在于河豚鱼和其它有毒海洋生物中。因阻滞钠离子通道，阻断神经肌肉电信号传导，引起肌肉麻痹和呼吸麻痹，导致人畜死亡，至今无特效抗毒药，所以加强食物中TTX的快速检测至关重要。本研究通过曼尼希法制备河豚毒素人工抗原，获得高特异性多克隆抗体，利用杂交瘤技术制备出抗河豚毒素单克隆抗体，并详细探讨了影响河豚毒素检测的因素，建立适合于实际应用的icELISA和dcTRFIA检测方法。
利用TTX结构特点选择合适的蛋白质载体牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和匙孔型血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，通过曼尼希法将半抗原河豚毒素与之偶联成为免疫原TTX-BSA及TTX-KLH。免疫6～8周龄Balb/c雌性小鼠，制备多克隆抗体；以卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)为载体蛋白，同样以曼尼希法制备包被抗原TTX-OVA。TTX-KLH多抗血清同时采用TTX-OVA和TTX-BSA作包被抗原检测，抗血清经间接酶联免疫吸附法以及间接竞争酶联免疫吸附法检测，结果发现TTX-KLH免疫获得的多抗血清较TTX-BSA免疫获得的多抗血清特异性高。以两种包被抗原进行检测，效价一致：均为1：64,000，而以TTX-OVA为包被原的检测值稍高，与TTX进行竞争酶联免疫检测，其IC50值波动范围为10～20 ng/ml。人工抗原TTX-KLH具有更好的免疫原性。
选取高特异性的TTX-KLH免疫小鼠的脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，以TTX-OVA为检测抗原经iELISA筛选阳性细胞，用有限稀释法对阳性细胞进行亚克隆，经过四次亚克隆后获得一株高特异性的细胞株。并通过诱生腹水法大量制备抗河豚毒素单克隆抗体，辛酸-饱和硫酸铵法纯化单克隆抗体，从而获得高特异性的抗河豚毒素单克隆抗体。
基于抗河豚毒素单克隆抗体建立间接竞争ELISA检测河豚毒素。结果表明，反应温度对剂量-效应曲线有显著影响，37℃下检测所得IC50值随着竞争反应时间的延长而增大，室温下的检测曲线性能较为稳定。建立的河豚毒素间接竞争ELISA检测法工作条件为：抗河豚毒素单克隆抗体工作浓度为750.0 ng/mL，包被抗原OVA-TTX的包被浓度为4.0μg/mL，竞争反应时间为45 min，反应温度为室温(20～25℃)，建立的标准曲线IC50值约为24.0 ng/mL，检测下限为2.2 ng/mL，定量检测范围5.2～107.6ng/mL，批内变异系数为4.2％，批间变异系数为4.5％。用所建立的方法检测河豚毒素类似物贝类毒素结果显示无交叉反应。对河豚鱼的肌肉、肝脏、卵巢提取液进行检测，发现无明显的基质干扰。
基于抗河豚毒素单克隆抗体建立时间分辨荧光免疫分析法检测河豚毒素。将铕荧光物质Eu3+-N2-[β-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)与河豚毒素单克隆抗体偶联制备Eu3+标记抗体，以OVA-TTX作为包抗原，优化包被抗原浓度、抗体浓度、反应温度、反应时间，发现所用Eu3+标记抗河豚毒素单克隆抗体对温度较为敏感，37℃下剂量-效应曲线的半数抑制浓度IC50随竞争反应时间延长而增大；而室温(20～25℃)下的检测曲线性能较为稳定，15～60 mm内时间对IC50基本没有影响；在一定抗体浓度下，曲线的半数抑制浓度IC50随OVA-TTX包被浓度的升高而增大。直接竞争时间分辨荧光免疫分析法(dcTRFIA)初步确定的优化条件为：包被抗原的包被浓度为4.0 μg/mL抗体浓度5.0 μg/mL、反应温度20～25℃、竞争反应时间45 min，反应一步完成。该方法的IC50为19.2 ng/mL，检测限为1.2 ng/mL，定量检测范围为3.0～123.3 ng/mL。dcTRFIA检测河豚毒素类似物贝类毒素发现无交叉反应。并对河豚鱼的肌肉、肝脏、卵巢提取液进行检测，发现无明显的基质干扰。