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无梗五加,又名短梗五加,是五加科五加属植物,具有广泛的药理活性,长期以来,在东北地区,代替刺五加药用,未见不良反应报道。其根皮即五加皮,具有悠久的药用历史,嫩茎俗称刺拐棒,是具有保健功能的山野菜,其果粉碎后制成的果茶,具有抗疲劳、降血压等功效。我省是无梗五加资源分布较广的地区,已实现人工栽培,因此开发该资源前景广阔。目前,对无梗五加的研究主要集中在根、茎、叶部位,对无梗五加果化学成分及其生物活性的研究报道很少,对黄酮化合物的研究未见报道。多糖和黄酮类化合物是植物中具有广泛生物活性的物质,本文对无梗五加果的多糖和黄酮化合物的提取纯化及生物活性进行了系统研究,主要结论如下:
1.采用水提醇沉法提取无梗五加果多糖,由正交试验得出最佳工艺条件为:浸提温度80℃,料液比1:70,提取时间3h。以提取两次为宜。提取液醇沉时,以5倍醇沉为宜。
2.从脱蛋白率和多糖保留率方面比较,Sevag法比三氯乙酸法更适于无梗五加果多糖中蛋白的脱除,最佳工艺参数为粗多糖液与Sevag试剂的体积比为4:1,氯仿和正丁醇的体积比为3:1。
3.脱蛋白脱色素后的精制多糖ASP经高效液相色谱分析,其单糖组成主要为核糖、果糖、甘露糖和半乳糖。硫酸咔唑反应表明其为酸性多糖。
4.分别采用pH7.8的磷酸缓冲液和水对DEAE-52柱进行平衡,以蒸馏水、0.1~0.5MNaCL洗脱多糖,发现水平衡条件下,更利于多糖洗脱;在两种不同的柱平衡条件下,相同离子强度的洗脱剂洗脱下的多糖组分不同。两种柱平衡条件下,洗脱所得主要多糖组分ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2纯度、分子量及单糖组成均不同。
5.采用HPLC-GPC对DEAE-52洗脱下的主要多糖ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2纯度和分子量测定表明,ASPⅡ-B2有8个高分子物质峰,其分子量分别为180.7Kd,179.1Kd,147.0Kd,45.4Kd,21.8Kd,11.7Kd,7.8Kd和4.3Kd。ASPⅠ-B2有5个高分子物质峰,其分子量分别为179.5Kd,21.0Kd,11.6Kd,7.7Kd,和4.3Kd。
6.经HPLC法检测ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2单糖组成,共检出:甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖共9种单糖,其中ASPⅡ-B2以半乳糖含量最高,占37.74%,其次为葡萄糖,为12.60%,鼠李糖为7.66%。糖醛酸含量较高,为酸性多糖。ASPⅠ-B2以葡萄糖和半乳糖含量居多,二者含量相差不大,分别为20.20%和22.92%,其次为鼠李糖9.46%,也为酸性多糖。红外光谱分析表明,二者均具有吡喃环特征吸收,既有α又有β糖苷键,为酸性糖。
7.采用HPLC-GPC对水平衡条件下DEAE-52洗脱下的多糖ASPⅡ-A的纯度和分子量测定表明,ASPⅡ-A为均一组分,分子量为18.1KD,经高效液相色谱分析其单糖组成主要为:半乳糖和鼠李糖。红外光谱分析表明其为中性多糖。
8.化学发光法表明,无梗五加果多糖具有清除羟基自由基和超氧自由基的作用。抗油脂试验表明,具有抗油脂氧化的性能。此外,具有一定的抑菌作用。初步的动物试验表明,无梗五加果多糖具有抗疲劳、耐缺氧和提高免疫力的作用。
9.硝酸铝显色法适于无梗五加果黄酮含量的测定,回收率为98.35%。正交试验表明,乙醇回流法提取无梗五加果黄酮的最佳提取条件为醇浓度50%,料液比1:80,提取时间4h,提取1次。
10.在进行筛选的8种树脂中,HPD600对黄酮的吸附量大,吸附率较高,易解吸,属快速吸附型树脂,是一种理想的黄酮吸附剂,适宜于对黄酮的提取分离。当上样液pH为5.06,浓度为0.5mg/mL,上样液与树脂用量之比为10:1,控制流速为1mL/min时,HPD600对黄酮的吸附率可达93.04%。低温有利于HPD600树脂的吸附,而高温则有利于该树脂的解吸。体积分数为70%的乙醇对黄酮的洗脱率最高,且洗脱物中黄酮纯度最高,控制解吸流速为1.0mL/min,洗脱体积为三倍柱床体积时,基本可以将黄酮完全洗脱下来。最终产品黄酮纯度可达86.79%。
11.经显色反应和紫外光谱扫描初步鉴别无梗五加果黄酮化合物类型可能为黄酮、黄酮醇、异黄酮。对无梗五加果总黄酮最佳层析体系进行了筛选,表明以聚酰胺为固定相、正丁醇-乙酸-水(4:1:5)或微乳液为展开剂效果较好。薄层定性分析表明,无梗五加果中不含芦丁和槲皮素。但含有药用成份金丝桃苷。为无梗五加果的开发利用提供了依据。
12.采用制备型高效液相从大孔树脂纯化后的无梗五加果总黄酮中分离制备金丝桃苷,产品纯度可达92%以上。与其他方法相比较,省时,省力,方便快捷。该产品经紫外、红外和核磁共振分析鉴定为金丝桃苷。经聚酰胺树脂进一步纯化,最终产品纯度可达98%以上。为无梗五加果金丝桃苷的有效利用起到了指导作用。
13.生物活性试验表明,无梗五加果黄酮具有清除羟基自由基和超氧自由基及抗油脂氧化的性能,并具有一定的抑菌作用。