玉米丝氨酸消旋酶作为新型筛选标记转化南抗杨的研究

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杨树作为林业生产中的模式植物,具有生长速度快、适应性强及产量大等优点,在保护环境和维持生态平衡以及作为工业原料方面发挥重要作用。南抗杨是速生和丰产性能优良的新品种。传统的选择标记基因可能会发生基因漂流,会对生态环境以及人类健康产生不良的影响。因此选择一个有效并且安全的筛选标记基因极为必要的。丝氨酸消旋酶(serine racemase, SR)作为一种双功能酶,同时具有消旋酶和脱水酶活性,不仅能将L-/D-丝氨酸转化成相应的D-/L-丝氨酸;而且可以将L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。丝氨酸消旋酶作为一种无抗性选择标记基因,对于植物中的D-丝氨酸具有解毒的功能,并且对于生态环境不会造成污染,是一种安全的筛选标记基因。因此研究该标记基因能否能在木本植物中高效表达,具有重要的科学意义和应用前景。本研究以南抗杨的叶片为受体材料,将含有ZmSR基因的质粒导入到根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法将ZmSR基因导入到南抗杨中,并对南抗杨的叶片和分化芽进行D-丝氨酸的抗性筛选,最终对已转化的抗性植株进行分子检测。实验获得了以下结果:(1)对重组载体进行Bstp Ⅰ、Nco Ⅰ双酶切验证,证明ZmSR基因正确连入表达载体;将质粒ZmSR进行测序,测序结果与玉米的丝氨酸消旋酶预测基因(NM001143028.1)序列比对结果完全一致,证明质粒pBI1301-ZmSR的正确性;制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞,并通过液氮冻融法将质粒pBI1301-ZmSR导入到LBA4404感受态细胞中。从农杆菌中提取质粒进行Bstp Ⅰ、Nco Ⅰ双酶切验证,结果得到ZmSR和pBI1301载体两个大小的片段。根据玉米丝氨酸消旋酶基因序列设计引物,对提取的农杆菌pBI1301-ZmSR质粒PCR验证,证明了重组质粒已成功导入农杆菌中,可以用来进行遗传转化。(2)进行了南抗杨叶片分化和不定芽生根的D-丝氨酸的敏感性试验,确定叶片分化的临界浓度为15mM,生根的临界浓度为12.5mM。(3)以南抗杨组培苗的叶片为材料,通过农杆菌介导法将pBI1301-ZmSR寻入到叶片以及愈伤组织进行遗传转化,并以pBI121-GS化南抗杨的叶片以及愈伤组织作为对照,对比试验发现转GUS基因的南抗杨叶片以及愈伤组织比转ZmSR基因分化率高,但转ZmSR基因的污染率较转GUS基因的污染率低。(4)筛选转化植株,最后共获得12株D-丝氨酸抗性苗,经分子检测共有3株植株为阳性植株。(5)炼苗移栽并对转基因植株的表型性状进行观察,非转基因植株作为对照,结果表明转ZmSR基因的叶片生长状况优于非转基因和转GUS基因的南抗杨,且转ZmSR基因的南抗杨株高明显高于转GUS基因的南抗杨。
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