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研究背景乳腺癌基质成纤维细胞可于肿瘤进展过程中活化成为癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF),并在乳腺癌进展中发挥促癌和抑癌双重作用。以乳腺癌基质成纤维细胞为靶点,改善肿瘤微环境,可提高肿瘤治疗效果。叉头框转录因子F2(Forkhead box F2,FOXF2)是FOX转录因子家族成员之一,特异性表达于临近上皮细胞的间质细胞,课题组前期研究表明FOXF2可负调控成纤维细胞中平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)编码基因ACTA2转录,进而促进成纤维细胞活化。进一步研究发现FOXF2能够与FGF1、PDGF等细胞因子编码基因启动子区结合,并抑制FGF1和PDGFD的表达。同时,FOXF2缺失可上调成纤维细胞中PDGFR表达,为酪氨酸激酶抑制剂Dasatinib提供作用靶点。因此,我们推测FOXF2可通过负调控FGF1和PDGFD转录促进成纤维细胞活化,同时Dasatinib可能具有抑制由FOXF2缺乏引起的成纤维细胞活化作用。目的本研究旨在阐明FOXF2转录调控乳腺癌成纤维细胞活化的作用和机制,并为靶向乳腺癌基质成纤维细胞治疗乳腺癌提供新依据。研究方法1.分别从浸润性导管癌的乳腺癌组织及其配对的癌旁正常乳腺组织中分离培养CAF和NF(normal fibroblast,NF),观察比较CAF和NF形态,利用Western blot方法检测上皮和间质细胞标志物E-cadherin和Vimentin表达,免疫荧光检测α-SMA定位和表达,以判断CAF和NF的间质细胞特性。利用RT-qPCR和Western blot方法检测CAF和NF中FOXF2 mRNA和蛋白表达水平,以确定FOXF2表达量与乳腺癌微环境中成纤维细胞活化的关系。采用RT-qPCR方法检测16例CAF和NF中FOXF2 mRNA和ACTA2 mRNA表达水平,确定FOXF2和ACTA2表达量与乳腺癌细胞分化程度和侵袭转移程度的关系。2.脂质体法瞬时转染si RNA,沉默NF和人胚肺成纤维细胞MRC-5中人源FOXF2及小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中鼠源Foxf2表达,获得NF-si FOXF2、MRC-5-si FOXF2、NIH3T3-si Foxf2及各自对照细胞;同时脂质体法瞬时转染含FOXF2 c DNA全长的重组真核表达质粒pc DNA3.1-HA-FOXF2(FOXF2-HA)和对照质粒(Vector)至CAF,获得CAF-FOXF2及其对照细胞。采用RT-qPCR和Western blot方法检测成纤维细胞活化标志物平滑肌肌动蛋白α、成纤维细胞活化蛋白、细胞粘合素及血小板源性生长因子受体等表达水平。F-actin聚合实验和胶原收缩实验比较成纤维细胞运动和收缩能力变化。确定FOXF2表达量改变对成纤维细胞活化的作用。3.染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,Ch IP)实验检测FOXF2与成纤维细胞活化相关靶基因(候选靶基因)启动子序列结合状态;构建含FOXF2转录结合域的候选靶基因启动子序列与荧光素酶报告基因载体p GL3-Basic重组质粒。采用双荧光素酶报告系统检测靶基因FGF1和PDGFD启动子活性。RT-qPCR方法检测沉默或过表达FOXF2的NF和CAF细胞中候选靶基因mRNA表达水平。确定FOXF2对FGF1、FGF2、PDGFC、PDGFD和CXCL12的转录调控作用。4.采用酪氨酸激酶抑制剂Dasatinib处理NIH3T3-si Foxf2,抑制细胞PDGFR活性。利用免疫荧光检测Dasatinib处理后NIH3T3中α-SMA定位和表达。F-actin聚合实验和胶原收缩实验检测Dasatinib处理对NIH3T3收缩和运动能力的影响。探索Dasatinib对FOXF2转录调控成纤维细胞活化的影响。结果1.分离培养CAF和NF,CAF和NF具有间质细胞特性;FOXF2 mRNA在CAF中表达水平较NF(n=8,P<0.05)下调;FOXF2蛋白在CAF中表达水平较NF下调。证实FOXF2缺失与成纤维细胞活化具有相关性。2.沉默FOXF2表达的NF和MRC-5及沉默Foxf2表达的NIH3T3细胞中成纤维细胞活化标志物ACTA2、FAP、和TNC mRNA表达均上调;沉默FOXF2表达的NF和沉默Foxf2表达的NIH3T3细胞中α-SMA、PDGFRα和PDGFRβ蛋白表达水平均上调;过表达FOXF2的CAF细胞中α-SMA、PDGFRα和PDGFRβ蛋白表达水平下调。沉默FOXF2表达的NF和沉默Foxf2表达的NIH3T3细胞组胶原表面积更小,F-actin成束分布。证实FOXF2表达缺乏可活化成纤维细胞,可增强成纤维细胞收缩和运动能力。3.Ch IP实验证实FOXF2可与FGF1、FGF2、PDGFC、PDGFD基因启动子序列结合;双荧光素酶报告系统证实FOXF2可抑制FGF1和PDGFD启动子转录活性;RT-qPCR方法证实FOXF2缺失可上调FGF1、PDGFC、PDGFD和CXCL12 mRNA表达。证实FOXF2可通过负调控FGF1和PDGFD的转录促进成纤维细胞活化。4.利用Dasatinib抑制细胞PDGFR活性后,沉默Foxf2表达的NIH3T3细胞收缩和运动能力较药物处理前细胞降低。提示Dasatinib可通过降低成纤维细胞PDGFR活性抑制FOXF2缺乏引起的成纤维细胞活化。结论FOXF2可通过转录负调控FGF1和PDGFD表达促进乳腺癌基质成纤维细胞活化,同时Dasatinib可通过抑制PDGFR活性,进而抑制FOXF2缺失引起的成纤维细胞活化作用。