表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等,且这种改变在发育和细胞增殖过程中能相对稳定地传递。DNA甲基化是表观遗学的重要研究内容之一。DNA甲基化及去甲基化,再加上组蛋白修饰,直接制约基因的活化状态。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高。另外,也有越来越多的研究证实DNA甲基化与动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、精神分裂症等多因素复杂性状疾病的发病密切相关。　　 牙周炎是一种多因素的复杂性疾病,包括三大相关因素:菌斑因素,环境因素和宿主因素。其中菌斑因素是始发因素,环境因素是危险因素,而宿主因素可能是决定因素。宿主的基因背景,可能决定了宿主反应的强弱,从而最终决定疾病的表现形式。已有很多研究证实一些编码抗体反应以及炎性介质的重要基因,包括IL-1A,IL-1B,IL-6,TNF-A,PGE2,COX-2等,其基因序列上出现的变异可能会改变机体某些组织结构,抗体反应以及炎性介质的调控,从而对牙周炎的易感性和严重程度产生影响。基因序列的差异可以影响个体对炎症的反应情况,而基因DNA甲基化的改变则可以调控这种基因的表达,从而动态地调节个体的炎症反应。这样就可以解释,有着完全相同遗传背景的两个个体,在不同的环境暴露下,通过表观遗传的调控,基因表达水平将出现差异。提示我们,除了基因多态性对牙周炎易感性的影响,个体在环境因素(牙周炎的危险因素)的作用下,一些与牙周炎相关基因的甲基化状态可能发生了改变,从而影响疾病的发生和发展,并且这种改变是可遗传的。　　 白介素-6(IL-6)是指活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子。能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；和集落刺激因子协同,能促进原始骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能。它可调节免疫应答、调节造血系统、诱导急性期蛋白合成、参与骨代谢等,尤其在宿主免疫防御反应中有着重要作用。IL-6参与了牙周炎的主要病理过程:可以促进牙槽骨的吸收；可以抑制牙周膜的修复；参与牙周炎的炎症反应。IL-6启动子区CpG岛的甲基化状态的改变,可能导致IL-6转录和表达的差异。目前对IL-6研究主要是有关基因多态性与个体易感性,尚未见到有关基因甲基化方面的文献报道。所以,我们对牙周炎患者基因组整体甲基化水平和与牙周炎密切相关基因IL-6的启动予甲基化状态进行研究,对牙周炎的表观遗传学特征作初步的探讨。　　 一、广东地区牙周炎人群资料库的建立　　 目的:建立牙周炎人群资料库　　 方法:取样时间为2007.08至2008.05,受试者来源于广东省口腔医院,广州医学院第二附属医院,南方医科大学附属珠江医院,以及广州市内海珠区,白云区,黄埔区等多个社区。所有受试者均符合以下条件:①年龄≥40岁；②至少有14颗可评估的牙(其中有4颗磨牙)。受试者的排除标准是:①患系统性疾病(如肿瘤、冠心病、糖尿病、肝炎、血液性疾病等)；②环境毒物接触史；③3个月内服用过抗生素:④怀孕的女性；⑤哺乳期的女性；⑥1年内接受过牙周治疗。受试者被分为两组:单纯慢性牙周炎组(CP组)和健康对照组(H组)。慢性牙周炎的诊断标准采用1999年牙周炎分类国际研讨会所推荐的临床标准,即为临床附着丧失(CAL)在30％以上的位点(含30％)≥3mm:牙周健康诊断标准为全口牙的牙周探诊深度≤3mm,无附着丧失,龈退缩≤1mm,出血指数≥2的位点不超过10％,无出血指数>4的位点。取样分3个步骤:①每位受试者填写一份调查问卷,包括性别、年龄、身高、体重、职业、大体健康情况、吸烟习惯、锻炼习惯、精神压力状况等信息资料；②取颊黏膜脱落细胞棉拭子；③受试者牙周检查:检查内容包括6个指数牙及每颗指数牙的6个位点的临床参数,包括牙周袋探诊深度(PD)、临床附着丧失(CAL)及探针出血(BOP)。最后资料录入,所有的颊黏膜棉拭子样本采用CHELEX-100法抽提基因组DNA,分光光度计检测DNA浓度,低温保存。　　 结果:共收集样本总数512例,其中CP组293例,H组219例。CP组包括189例男性和104例女性,年龄范围40-85岁,平均50.84±10.00岁。H组包括105例男性和114例女性,年龄范围40-83岁,平均49.50±9.74岁。　　 结论:初步建立了广东地区牙周炎人群的调查问卷信息库、牙周临床数据库和生物样本库,为开展牙周炎病因学研究积累了工作经验,为长期补充、完善数据库打下基础。　　 二、高效液相色谱法检测牙周炎患者基因组整体甲基化水平的研究　　 目的:通过比较牙周炎人群与牙周健康人群基因组整体甲基化水平差异,了解基因组整体甲基化水平与牙周炎易感性的关系　　 方法:实验样本来第一章建立的数据库。从第一章建立的数据库中随机抽取实验样本:CP组,牙周炎患者46例；H组,健康对照者37例。高效液相色谱法检测(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)主要步骤:DNA提取后酶解成五种胞苷,包括脱氧鸟苷(dG)、脱氧胸苷(dT)、脱氧胞苷(dC)、脱氧腺苷(dA)、5-甲基脱氧胞苷(5_m。C)。分别配制5种脱氧核苷标准品溶液,通过每种标准品不同浓度和各脱氧核苷HPLC峰面积作回归分析,优化分离效果得到最佳色谱条件。完成阴性对照试验、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验。DNA水解产物通过色谱柱,并与标准品相比较,用紫外光测定吸收峰值及其量,计算5-MC/(5-m C+5C)的积分面积得到样本5m-C含量,代表样本基因组整体的甲基化水平。最后SPSS13.0统计分析软件统计分析:①样本特征的统计分析,计数资料(性别、吸烟、精神压力)用卡方检验,计量资料(年龄、体重指数BMI)t检验；②用t检验分析CP组和H组5-m C含量的差异；③多因素logistic回归评价年龄、性别、吸烟、精神压力、体重指数(BMI)和5-m C含量是否为牙周炎的危险因素;④检验分析以性别、吸烟、精神压力分组5-m C的含量的差异；年龄和BMI与5-m C的含量作相关分析:⑤年龄与5-m C含量做线性回归分析。　　 结果:CP组共46例:其中男34例,女12例；年龄51.28±9.98岁(均数±标准差)；BMI21.91±2.99；吸烟者22例,非吸烟者24例；有精神压力者34例,无精神压力者12例。H组共37例:其中男13例,女24例；年龄47.30±6.03岁；BMI21.82±5.16；吸烟者7例,非吸烟者30例；有精神压力者14例,无精神压力者23例。阴性对照试验、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验结果表明HPLC测定结果稳定、可靠。CP组基因组中5-m C含量(3.36±0.023％)与H组(3.43±0.023％)差异没有统计学意义(p>0.05)。多因素回归分析提示5-m C含量、性别、BMI不是牙周炎的危险因素,而性别(B=2.267,W=7.598,P=0.006)和精神压力(B=-1.951,W=8.601,P=0.003)则可能是牙周炎的危险因素。以性别、吸烟、精神压力分组5-m C的含量差异没有统计学意义(p>0.05)。年龄和5-m C含量呈负相关关系(r=-0.776,P=0.006)。　　 结论:随着年龄的增长,基因组整体甲基化水平呈下降趋势,尚不能认为基因组整体甲基化水平改变是牙周炎的危险因素,亦不能认为性别、吸烟、精神压力、BMI是基因组整体甲基化水平的危险因素；而性别和精神压力可能是牙周炎的危险因素之一。　　 三、MSP法对牙周炎患者IL-6基因启动子甲基化情况的研究　　 目的:通过比较牙周炎人群与牙周健康人群IL-6基因启动子甲基化水平差异,了解IL-6基因启动子甲基化与牙周炎易感性的关系　　 方法:实验样本来第一章建立的数据库。从第一章建立的数据库中随机抽取实验样本:CP组,牙周炎患者46例；H组,健康对照者45例。采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MS—PCR),主要步骤:①DNA提取②DNA亚硫酸氢盐处理及纯化③分析IL-6基因启动子中CPG位点,用Primer Premier5.0引物设计专门软件设计MSP检测引物序列④引物特异性的PCR⑤采用SPSS13.0进行统计分析:样本特征的统计分析,计数资料(性别、吸烟、精神压力)用卡方检验,计量资料(年龄、体重指数BMI)t检验；卡方检验对CP组和H组IL-6启动子甲基化阳性率进行比较；多因素logistic回归分析其相关因素(性别、年龄、精神压力、吸烟、分组)是否为IL-6甲基化阳性的危险因素。　　 结果:CP组共44例:其中男33例,女11例；年龄50.41±9.98岁；BMI21.99±4.56；吸烟者20例,非吸烟者24例；有精神压力者32例,无精神压力者12例。H组共37例:其中男13例,女24例:年龄46.40±5.16岁；BMI21.96±2.94；吸烟者34例,非吸烟者11例；有精神压力者17例,无精神压力者28例。CP组,IL-6基因启动子区域甲基化阳性30例,阳性率为68.18％；H组甲基化阳性42例,阳性率为93.33％,x2=9.108,P=0.003(P<0.05),两组差异有统计学意义。性别、年龄、精神压力、吸烟不是IL-6甲基化的危险因素,牙周炎是IL-6甲基化危险因素(B=2,450,W=8.450,P=0.004.OR=11.592,95％CI=2.221-60.488)。　　 结论:IL-6基因启动子的去甲基化状态可能与牙周炎的易感性相关,尚不能认为性别、年龄、精神压力、吸烟是IL-6甲基化的危险因素。