[目的]　　1.研究过氧化氢对IL-37表达的影响。　　2.从细胞水平研究IL-37过表达对细胞氧化应激损伤的保护作用。　　[方法]　　1.过氧化氢对细胞增殖的影响。用不同浓度过氧化氢(25、50、100、200、500、1000和1500μmol/L)作用人脐静脉血管内皮细胞(EA.hy926)和人胚肾细胞(293T)不同时间（1、3、6、9、12和20 h）后，采用CCK8法检测过氧化氢对细胞增殖的影响。　　2.过氧化氢对细胞活性的影响。用不同浓度过氧化氢作用EA.hy926细咆不同时间后，收集细胞及其培养液上清，分别检测上清中乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)和细胞内丙二醛(Malonaldehyde，MDA)水平。　　3.过氧化氢对细胞IL-37表达的影响。用实时荧光定量PCR检测过氧化氢刺激对EA.hy926细胞和293T细胞IL-37 mRNA表达的影响;用Western blot检测过氧化氢刺激对EA.hy926细胞和293T细胞IL-37蛋白水平的影响。　　4.过氧化氢诱导细胞IL-37表达的信号转导通路分析。分别用5种不同的信号通路分子抑制剂，即p38MAPK抑制剂（SB203580，10μmol/L）、MEK1/2抑制剂（U0126，5μmol/L）、JNK抑制剂(SP600125，10μmol/L)、JAK抑制剂(AG490，10μmol/L)和PI3K抑制剂(LY294002，5μmol/L)预先作用EA.hy926细胞30 min后，加入100μmol/L过氧化氢，分别作用3h和20 h。收集细胞，分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测IL-37 mRNA及其蛋白表达水平。　　5.IL-37真核表达载体的构建。采用PCR技术分别扩增IL-37和EGFP基因，经酶切和测序鉴定正确后，克隆入真核表达载体pcDNA3.1，用一段柔性Linker(GGGGS)3将两个目的基因片段相连，构建出IL37-1inker-EGFP融合基因真核表达质粒。将其转染至293T细胞中，荧光显微镜观察IL-37-EGFP融合蛋白表达情况，实时荧光定量PCR和Western blot检测IL-37 mRNA和蛋白表达。　　6.将重组质粒转染293T细胞使其过表达IL-37基因后，用500μ mol/L过氧化氢作用293T细胞20 h，以CCK8法检测细胞活力;另收集培养液上清，检测其中LDH水平。　　[结果]　　1.过氧化氢对EA.hy926细胞增殖的影响　　不同浓度H2O2（25、50、100、200、500、1000和1500μmol/L）处理EA.hy926细胞1、3、6、9、12和20 h后，用CCK-8法检测其细胞活力。结果显示，较低浓度H2O2（25、50和100μmol/L）对EA.hy926细胞的增殖影响较小，即使培养至20 h，细胞活力仍保持在90％以上，与空白对照组比较没有显著性差异（P＞0.05）。但是随着H2O2浓度升高，细胞的相对细胞活力逐渐受到明显的影响，用200μmol/L H2O2作用细胞3h时，细胞相对活力下降至87.4％，与对照组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。当H2O2浓度继续升高至500μmol/L以上时，即使作用细胞1h，细胞活力也显著下降，与对照组相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并且随着作用时间延长，细胞的相对活力进一步降低。　　2.过氧化氢对293T细胞增殖的影响　　不同浓度H2O2（100、200、500和1000μmol/L）处理293T细胞20 h后，用CCK-8法检测其细胞活力。结果显示，200μmol/L过氧化氢处理组细胞活力开始降低，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，并且随着浓度升高，细胞活力逐渐降低。　　3.过氧化氢对EA.hy926细胞活性的影响　　不同浓度过氧化氢刺激EA.hy926细胞不同时间后，收集细胞及其上清检测其LDH和MDA水平。结果显示，用50和100μmol/L等低浓度的过氧化氢处理细胞时，上清中LDH水平的变化无明显差异（P＞0.05）。当用200μmol/L的过氧化氢处理细胞时，只有作用持续至20 h时，上清中LDH水平的变化才有明显差异(P＜0.05)。进一步升高过氧化氢的作用浓度时，即使作用短时间，上清中LDH水平也呈显著的上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)。当用50μmol/L浓度的过氧化氢处理细胞时，其MDA水平无明显变化(P＞0.05)，但当过氧化氢浓度上升至100μmol/L时，MDA水平则明显升高，与对照组相比较具有显著差异（P＜0.05），并随着过氧化氢浓度的进一步升高，MDA的水平也随之进一步升高。　　4.过氧化氢对EA.hy926细胞IL-37表达的影响　　不同浓度H2O2作用EA.hy926细胞后，实时荧光定量PCR检测IL-37表达水平的变化。结果显示，当4个不同浓度的H2O2处理细胞1h时，只有25μmol/LH2O2处理组未见有IL-37 mRNA水平明显升高，其他3个浓度处理组细胞IL-37mRNA水平明显升高，其中，H2O2作用浓度上升至200μmol/L时，细胞IL-37mRNA水平比对照组高4.6倍，与对照组相比较，具有非常显著差异的统计学差异(P＜0.01)。当H2O2处理细胞时间上升至3h时，IL-37mRNA的表达水平继续升高，其中100和200μmol/L H2O2处理组细胞IL-37 mRNA的表达水平分别高于对照组约4.4和4.9倍，与对照组相比较，具有非常显著差异（P＜0.01）。当H2O2处理细胞时间上升至6h时，IL-37 mRNA仅比作用3h时稍升高或略降低。Western blot结果显示用100μmol/L过氧化氢作用EA.hy926细胞20 h，细胞内IL-37蛋白呈明显的上调表达。　　5.过氧化氢对293T细胞IL-37表达的影响　　不同浓度H2O2作用293T细胞后，实时荧光定量PCR检测IL-37表达水平的变化。结果显示，用25和50μmol/L过氧化氢作用1、3、6h后，IL-37 mRNA水平均未见明显升高（P＞0.05）;当过氧化氢浓度升高至100μmol/L并作用3h后，IL-37表达水平较对照组升高(P＜0.05);而200μmol/L组作用3h后IL-37升高更加明显(P＜0.01);当作用时间延长至6h，100和200μmol/L组IL-37水平较3h继续升高，与对照组相比差异均非常显著(P＜0.01)。Western blot结果显示分别用25、50、100和200μmol/L过氧化氢作用293T细胞20 h，100和200μmol/L处理组细胞内IL-37蛋白呈明显的上调表达。　　6.5种不同信号通路分子抑制剂对过氧化氢诱导EA.hy926细胞IL-37表达的影响　　EA.hy926细胞经p38MAPK抑制剂(SB203580)、MEK1/2抑制剂(U0126)、JNK抑制剂(SP600125)、JAK抑制剂(AG490)和PI3K抑制剂(LY294002)预处理30 min后，加入100μmol/LH2O2作用3h，实时荧光定量PCR检测，结果表明，与未使用抑制剂的对照组相比较，使用SB203580、AG490和LY294002的各组细胞内IL-37 mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)，而U0126和SP600125组细胞内IL-37表达水平稍有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。而Westernblot结果显示:与未用抑制剂组相比，各抑制剂组IL-37水平均有降低，其中SB203580、AG490、SP600125和LY294002组降低明显。　　7.IL-37融合EGFP的真核表达载体的构建　　酶切和测序鉴定结果显示，IL37-linker-EGFP融合基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1。重组表达质粒pcDNA3.1-IL37-EGFP转染293T细胞后，荧光显微镜检测显示绿色荧光蛋白在细胞中表达;实时荧光定量PCR与Western blot分别检测到高水平IL-37 mRNA和蛋白水平的表达。　　8.过氧化氢对过表达IL-37的293T细胞增殖的影响　　以500μmol/L过氧化氢作用过表达IL-37基因的293T细胞20 h后，CCK8检测结果显示:与对照组相比，细胞活力显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　9.过氧化氢对过表达IL-37的293T细胞活性的影响　　用500μmol/L过氧化氢作用过表达IL-37基因的293T细胞20 h后，细胞培养上清中LDH活性显著低于对照组(P＜0.01)。　　[结论]　　1.研究发现过氧化氢具有上调EA.hy926和293T细胞IL-37表达的作用。　　2.研究发现抑制p38MAPK、JAK、PI3K的活性对过氧化氢上调IL-37表达具有强烈的抑制作用，提示过氧化氢可能通过活化p38MAPK、JAK和PI3K等信号通路诱导IL-37的上调表达。　　3.研究发现IL-37过表达可以减轻由过氧化氢诱导的293T细胞的氧化应激损伤，提示IL-37可能对氧化应激损伤具有保护作用。