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研究背景:饮酒可以诱发多种心血管系统疾病,如冠状动脉疾病、高血压、动脉粥样硬化、外周血管疾病、中风等。上述疾病的发生多与乙醇引起的血管功能障碍有关。临床研究发现,乙醇可直接作用于冠状动脉,使冠状动脉痉挛,亦可通过兴奋交感神经、使儿茶酚胺类物质分泌过多而收缩冠状动脉,从而导致心肌的血供和氧供不足,进而诱发心绞痛、心肌梗死、甚至冠心病猝死等冠状动脉疾病。基础研究发现,急性乙醇干预可收缩犬、猪和羊的冠状动脉,但也有文献报道,乙醇可以舒张猪的冠状动脉,增加荷兰猪的冠状动脉血流。澄清乙醇对冠状动脉的影响是探讨乙醇与冠状动脉疾病关系的前提,然而其对冠状动脉的作用尚未完全清楚,因此乙醇对冠状动脉血管运动性的作用及其机制尚需进一步明确。研究发现,乙醇可增强内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）对麻醉大鼠的血管收缩反应及苯肾上腺素对大鼠肠系膜动脉的收缩作用。也有研究报道,乙醇和逐渐升高的体温对家兔离体颈动脉有协同收缩作用。在体内,内源性缩血管物质持续地作用于血管系统,它们是否会影响乙醇对冠状动脉的作用鲜有报道。电压依赖性钾通道（Voltage-gated K+channels,KV）是维持血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）正常膜电位和肌张力的重要通道。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路在多种心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用。乙醇可使犬基底动脉、大鼠大脑中动脉、大鼠主动脉和肠系膜动脉MAPK通路蛋白表达增加,MAPK通路蛋白参与包括VSMC在内的多种细胞KV电流的调节。但乙醇对大鼠冠状动脉（Rat coronary artery,RCA）的作用是否与KV通道和MAPK通路有关,尚需进一步明确。本文主要研究乙醇对大鼠离体冠状动脉的作用及缩血管物质对乙醇作用的影响,并进一步探讨乙醇作用与KV通道和MAPK通路的关系,为临床防治饮酒引起的冠状动脉性疾病提供思路及药理学理论依据。本课题分为三部分第一部分乙醇对大鼠离体冠状动脉肌张力的作用目的:1.观察乙醇对离体RCA血管环静息张力的作用及内源性收缩剂KCl、血栓素A2类似物（U46619）和ET-1对乙醇作用的影响。2.利用去钙-复钙的方法,研究在轻度刺激条件下,乙醇收缩RCA血管环对细胞外钙内流和内钙释放的依赖性。3.观察在轻度刺激基础上,MAPK通路抑制剂对乙醇收缩RCA的影响。方法:1.离体RCA血管环的制备:腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠,断头处死,放血后迅速取出心脏,放入盛有预冷（4℃）、p H 7.4且O2饱和的正常生理盐溶液（Physiological salt solution,PSS）中。在解剖显微镜下依次小心分离出冠状动脉的室间隔支、右旋支和前降支。用比冠状动脉内径稍细的金属丝轻轻穿过血管环,反复2-3次,机械性去除冠状动脉血管内皮后,修剪成长度约为2 mm的血管环,将血管环固定于Multi Myograph System-610离体微血管环张力记录仪（DMT）浴槽中。浴槽中PSS液保持37℃恒温,持续O2饱和。调整血管环张力处于最适前负荷状态（相当于80 mm Hg）,并在浴槽中温育1 h后用60 m M KCl连续刺激血管环,当相邻两次刺激的收缩幅度相差不超过10%,认为血管环反应性良好,选取收缩幅度大于2 m N的血管环用于实验。2.乙醇对静息RCA张力的影响:在DMT浴槽中累积加入乙醇,使其终浓度分别为0.8、2.5、8 mg/ml,观察静息状态下RCA血管环张力的变化。加入不同浓度乙醇时,需待前一个浓度收缩达坪台后再加入下一个浓度。以60 m M KCl收缩血管环的幅度为100%,计算不同浓度乙醇收缩RCA的百分比。乙醇对轻度刺激RCA张力的影响:向浴槽中分别加入低浓度血管收缩剂（其所致的收缩幅度约为60 m M KCl收缩的5-20%）:30 m M KCl、0.3μM U46619或3n M ET-1,待血管收缩达坪台时,再向浴槽中累积加入0.8、2.5、8 mg/ml的乙醇,观察在预收缩基础上,乙醇对RCA张力的作用。以60 m M KCl收缩血管环的幅度为100%,计算不同浓度乙醇收缩RCA的百分比。3.乙醇收缩RCA对细胞外钙内流和细胞内钙释放的依赖性:用60 m M KCl刺激RCA血管环,当血管收缩稳定后,用含0.5 m M EGTA的无钙PSS液洗脱3次,并孵育20 min,使细胞内外达到近似无钙状态。然后向含无钙液的浴槽中加入8mg/ml乙醇,血管环收缩达相对坪台时,加入2.5 m M Ca Cl2;收缩再次达坪台时,用含0.5 m M EGTA的无钙PSS液洗脱3次,待血管环恢复静息张力后向含无钙液的浴槽中加入0.3μM U46619,血管环收缩达坪台时,加入2.5 m M Ca Cl2;收缩再次达坪台时,用含0.5 m M EGTA的无钙PSS液洗脱3次,待血管环恢复静息张力后加入0.3μM U46619,收缩至坪台,加入8 mg/ml乙醇,稳定后,加入2.5 m M Ca Cl2,观察血管环的收缩变化。以60 m M KCl收缩血管环的幅度为100%,计算乙醇在无钙或含钙液中的收缩幅度。L-型钙通道阻滞剂硝苯地平对乙醇收缩RCA作用的影响:待RCA血管环稳定后,向浴槽中加入0.3μM U46619,收缩达坪台时,向浴槽中累积加入0.8、2.5、8mg/ml的乙醇,使RCA发生浓度依赖性收缩。待8 mg/ml乙醇收缩达坪台后,用正常PSS液洗脱,使血管环恢复静息张力。血管环休息约1 h后,再次向浴槽中加入0.3μM U46619,待收缩达坪台,用L-型电压依赖性钙通道（L-type voltage-gated Ca2+channels,LVGC）阻断剂硝苯地平（Nifedipine,Nife,0.1μM）预孵10 min后,累积加入0.8、2.5、8 mg/ml乙醇,观察LVGC通道阻断剂是否会影响乙醇对RCA的收缩作用。结果以60 m M KCl收缩血管环的幅度为100%,计算预孵Nife前后乙醇的收缩百分比。4.MAPK抑制剂对乙醇收缩RCA作用的影响:向浴槽中加入0.3μM U46619或30 m M KCl,待收缩达坪台,向浴槽中累积加入0.8、2.5、8 mg/ml的乙醇,使冠状动脉发生浓度依赖性收缩。待8 mg/ml乙醇收缩达坪台后,用正常PSS液洗脱,使血管环恢复静息张力。血管环休息约1 h后,再次向浴槽中加入0.3μM U46619或30 m M KCl,待收缩达坪台,用MAPK通路抑制剂p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂（SB239063,1μM）或细胞外信号调节激酶抑制剂（PD98059,3μM）预孵10 min后,累积加入0.8、2.5、8 mg/ml乙醇,观察MAPK通路抑制剂是否会影响乙醇对RCA的收缩作用。结果以60 m M KCl收缩血管环的幅度为100%,计算预孵不同抑制剂前后乙醇的收缩百分比。结果:1.乙醇对RCA的收缩作用:不同浓度的乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对静息状态的RCA作用微弱（P>0.05）。以60 m M KCl的收缩幅度（6.98±0.74 m N）为100%,乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）收缩幅度的绝对值分别为0.05±0.02 m N、0.07±0.01 m N、0.12±0.03 m N,分别相当于60 m M KCl收缩幅度的0.77±0.21%、0.94±0.12%、1.71±0.32%。0.3μM U46619、30 m M KCl及3 n M ET-1收缩RCA的幅度分别为1.03±0.10m N、0.75±0.03 m N、0.76±0.03 m N,分别相当于60 m M KCl收缩幅度的17.57±2.46%、10.41±1.71%、13.58±1.06%。在预收缩基础上,乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）可浓度依赖性显著增强离体RCA的张力（P<0.05）。在0.3μM U46619预收缩基础上,乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）收缩幅度的绝对值分别为1.66±0.33 m N、3.41±0.69m N、5.68±0.67 m N,分别相当于60 m M KCl收缩幅度的28.02±4.97%、57.13±8.01%、95.78±7.14%。在30 m M KCl或3 n M ET-1预收缩基础上,8 mg/ml乙醇收缩RCA的Emax值分别相当于60 m M KCl收缩幅度的55.35±7.51%和66.02±7.85%。2.乙醇收缩RCA对细胞外钙内流和细胞内钙释放的依赖性:在无钙PSS液中,8 mg/ml乙醇收缩RCA的幅度为0.05±0.01 m N,仅相当于60 m M KCl的0.73±0.21%,复钙后收缩幅度增加至0.13±0.03 m N,相当于60 m M KCl的2.06±0.57%;在无钙PSS液中,0.3μM U46619收缩RCA的幅度为0.33±0.12 m N,仅相当于60m M KCl的5.12±1.98%,复钙后收缩幅度增加至1.61±0.74 m N,相当于60 m M KCl的24.02±6.49%;在无钙PSS液中,8 mg/ml乙醇对用0.3μM U46619轻度刺激的的RCA张力无显著影响（P>0.05）,其收缩幅度仅为0.43±0.08 m N,相当于60 m MKCl的6.68±1.57%;复钙使乙醇对U46619预收缩的RCA的收缩作用明显增强（P<0.05）,收缩幅度为4.36±0.89 m N,相当于60 m M KCl的66.96±8.18%。在0.3μM U46619轻微刺激基础上,预孵0.1μM Nife后,乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对RCA的收缩作用明显减弱（P<0.05）,最大收缩百分率由25.90±4.2%、29.72±4.38%、80.59±12.08%分别减少至9.59±3.55%、11.73±2.51%、31.30±4.26%。3.MAPK抑制剂对乙醇收缩RCA作用的影响:SB239063和PD98059均可显著减弱乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对0.3μM U46619轻微刺激的RCA的收缩作用（P<0.05）。预孵SB239063使乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）)的最大收缩百分率由27.20±4.25%、49.33±8.05%、98.76±5.50%分别减少至18.87±3.11%、26.61±4.95%、65.91±7.50%;预孵PD98059可使乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）的最大收缩百分率分别减少39.90±4.28%、58.76±5.19%、59.94±6.33%。同样,SB239063和PD98059也可显著减弱乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对30 m M KCl轻微刺激的RCA的收缩作用（P<0.05）。预孵SB239063使乙醇（0.8,2.5,8mg/ml）的最大收缩百分率由12.64±2.82%、16.97±1.49%、50.04±4.25%分别减少至10.40±1.28%、13.28±1.15%、27.62±3.24%;预孵PD98059可使乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）的最大收缩百分率分别减少19.18±2.25%、20.12±3.46%、48.85±5.47%。结论:1.乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对静息状态的RCA收缩作用较弱;用U46619、ET-1或高钾轻度刺激可显著增强RCA对乙醇的收缩反应。在轻度刺激条件下,乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）可浓度依赖性地强烈收缩RCA。2.在轻度刺激条件下,乙醇收缩RCA所需要的Ca2+主要依赖于细胞外钙内流;LVGC可能是乙醇收缩RCA过程中细胞外钙内流的主要来源。3.预孵SB239063和PD98059均可抑制乙醇（0.8,2.5,8 mg/ml）对受轻度刺激的RCA的收缩作用,提示乙醇收缩RCA的机制可能与MAPK信号通路的激活有关。第二部分乙醇对急性分离的大鼠冠状动脉平滑肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的影响目的:1.观察乙醇对大鼠冠状动脉平滑肌细胞（Rat coronary arterial smooth muscle cell,RCASMC）KV电流的影响。2.观察MAPK通路抑制剂对乙醇减小RCASMC KV电流的影响。方法:1.RCASMCs的分离:将去内皮的RCA血管环放入细胞酶解液Ⅰ（细胞分离液中加入0.5 mg/ml木瓜蛋白酶,1 mg/ml白蛋白,1 mg/ml二硫丁四醇）中,孵育15-20min后,将血管环转移至细胞酶解液Ⅱ（细胞分离液中加入0.5 mg/ml胶原蛋白酶F,0.5 mg/ml胶原蛋白酶H,1 mg/ml白蛋白）中,孵育6-10 min,离心,弃去上清后,得到RCASMCs。分离全程在37℃恒温且O2饱和条件下进行。2.采用全细胞膜片钳实验技术,记录乙醇对RCASMC KV电流的影响:（1）为研究乙醇对RCASMC KV电流的浓度依赖性,待正常KV电流稳定后,在细胞槽中累积加入不同浓度的乙醇（2.5,8,25mg/ml）,每加入一个浓度的乙醇2 min后记录KV电流的变化,电流稳定后再加入下一个浓度。（2）为探讨乙醇对轻度刺激条件下RCASMC KV电流的作用,待正常KV电流稳定后,在细胞槽中加入0.3μM U46619预孵2 min,记录KV电流,之后加入8 mg/ml乙醇,2 min后再次记录KV电流。（3）为研究MAPK通路抑制剂对乙醇减少RCASMC KV电流的影响,待正常KV电流稳定后,在细胞槽中加入SB239063（1μM）或PD98059（3μM）预孵2 min后,记录KV电流,之后加入8 mg/ml乙醇,2 min后再次记录KV电流。结果:1.在测试电压为+60 m V时,RCASMC正常KV电流强度为810.73±93.77 p A,电流密度为59.57±5.11 p A/p F。8 mg/ml乙醇和25 mg/ml乙醇均可使KV电流显著减小（P<0.05）,其电流密度分别为27.66±3.69 p A/p F和25.84±4.31 p A/p F,电流密度减小的幅度分别为53.6±6.11%和56.6±7.15%,但二者之间无统计学差异（P>0.05）。2.5 mg/ml乙醇对KV电流无显著影响（电流密度为53.73±7.73 p A/p F,P>0.05）。2.在测试电压为+60 m V时,0.3μM U46619预孵2 min后,KV电流密度为42.06±6.63 p A/p F,与正常RCASMC比较KV电流密度减小了29.39±4.23%（P<0.05）,加入8 mg/ml乙醇后,KV电流密度为19.04±2.88 p A/p F,电流密度减小幅度为68.04±7.12%（P<0.05）,而8 mg/ml乙醇单独可使RCASMC KV电流密度减小53.6±6.11%（P<0.05）。3.在测试电压为+60 m V时,RCASMC正常KV电流密度为59.57±5.11p A/p F,预孵SB239063 1μM后KV电流无明显变化（电流密度55.99±6.59 p A/p F,P>0.05）,之后加入8 mg/ml乙醇,KV电流无明显减小（电流密度52.33±4.69 p A/p F,P>0.05）;预孵PD98059 3μM后KV电流无明显变化（电流密度53.17±7.46 p A/p F,P>0.05）,之后加入8 mg/ml乙醇,KV电流无明显减小（电流密度51.23±7.07 p A/p F,P>0.05）。而8 mg/ml乙醇单独可明显减小RCASMC KV电流（电流密度27.66±3.69p A/p F,P<0.05）。结论:1.乙醇单独抑制RCASMC KV电流,但无浓度依赖性。在轻度刺激存在下,乙醇对RCASMC KV电流抑制作用增强。2.SB239063和PD98059抑制乙醇对RCASMC KV电流的减小作用,提示乙醇减小RCASMC KV电流的机制可能与MAPK信号通路的激活有关。第三部分乙醇对大鼠冠状动脉平滑肌细胞电压依赖性钾离子通道蛋白表达和MAPK通路蛋白磷酸化的影响目的:1.观察乙醇对RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白及p38、p44/42磷酸化水平的影响。2.观察MAPK通路抑制剂在乙醇减少RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白表达中的作用。方法:1.乙醇对RCASMC KV通道不同亚型及MAPK蛋白磷酸化水平的影响:将从每只大鼠心脏上急性分离得到的冠状动脉血管环去除内皮后随机平均分为四组:control组、U46619 0.3μM组、乙醇8.0 mg/ml组和U46619 0.3μM+乙醇8.0 mg/ml组,分别放入12孔细胞培养板的4孔中,孔中含有正常PSS液。收集至每孔含有8只大鼠的冠状动脉血管环后分别孵育相应组的药物,37℃孵育2 h后取出各组血管环,液氮中速冻后,-80℃保存。每组有4个样本（n=4）,每个样本包括8只大鼠的冠状动脉血管环。用Western blot法检测各组样本KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白及p38、p44/42磷酸化水平的变化。2.MAPK通路抑制对乙醇抑制RCASMC KV通道蛋白表达的影响:将从每只大鼠心脏上急性分离得到的冠状动脉血管环去除内皮后随机平均分为四组:control组、乙醇8.0 mg/ml组、SB239063 1μM组和乙醇8.0 mg/ml+SB239063 1μM组,或control组、乙醇8.0 mg/ml组、PD98059 3μM组和乙醇8.0 mg/ml+PD98059 3μM组,分别放入12孔细胞培养板的4孔中,孔中含有正常PSS液。收集至每孔含有8只大鼠的冠状动脉血管环后,乙醇8.0 mg/ml+SB239063 1μM组和乙醇8.0mg/ml+PD98059 3μM组RCA血管环先分别置于含SB239063（1μM）或PD98059（3μM）的PSS液中,37℃预孵20 min后,加入乙醇8.0 mg/ml继续孵育2 h,其余各组分别37℃孵育相应组的药物,2 h后取出各组血管环,液氮中速冻后,-80℃保存。每组有4个样本（n=4）,每个样本包括8只大鼠的冠状动脉血管环。用Western blot法检测各组样本KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白表达的变化。结果:1.与Control组相比,乙醇8.0 mg/ml可减少RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5和KV9.3通道蛋白的表达（P<0.05）,减少的百分率分别为34.58±2.58%、31.46±4.57%、26.23±2.09%和35.61±4.99%;U46619 0.3μM减少RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5和KV9.3通道蛋白表达的百分率分别为23.88±3.46%、28.82±4.38%、30.36±3.64%和27.64±3.31%（P<0.05）;U46619 0.3μM+乙醇8.0 mg/ml可显著减少KV1.1、KV1.2、KV1.5和KV9.3通道蛋白的表达（P<0.05）,减少的百分率分别为65.16±7.47%、73.39±6.88%、69.40±5.33%和64.19±6.95%。乙醇8.0 mg/ml使RCASMC p38和p44/42蛋白磷酸化水平分别增加122.68±20.12%和52.05±14.35%（P<0.05）,U46619 0.3μM分别增加96.67±13.25%和60.09±14.69%（P<0.05）,U46619 0.3μM+乙醇8.0 mg/ml则使p38和p44/42的蛋白磷酸化水平分别显著增加441.07±37.98%和442.63±48.82%（P<0.05）。2.SB239063和PD98059对RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白表达无影响（P>0.05）,但均可抑制乙醇8.0 mg/ml对上述KV通道蛋白表达的减少作用。结论:1.乙醇可使RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白表达减少,使p38、p44/42磷酸化水平增加,U46619和乙醇在抑制上述钾通道表达和促进MAPK蛋白磷酸化方面有协同作用。2.SB239063和PD98059可抑制乙醇对RCASMC KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV9.3通道蛋白表达的减少作用,提示MAPK信号通路可能参与了乙醇对RCASMC KV通道蛋白表达的抑制作用。全文结论:1.乙醇对轻度刺激的RCA产生明显的收缩作用。2.乙醇可增加RCASMC MAPK通路蛋白磷酸化水平,抑制KV电流,减少KV通道蛋白表达;MAPK通路抑制剂可抑制乙醇收缩RCA、抑制乙醇对RCASMC KV电流的减小作用及抑制乙醇对RCASMC KV通道蛋白表达的减少作用。提示,乙醇可通过增加MAPK通路蛋白磷酸化水平继而抑制KV通道功能和蛋白表达,最终导致RCA张力增高。