纳米技术的飞速发展带动了纳米医学的发展,越来越多的纳米粒被应用于生物传感、同步成像、药物输送和癌症诊断等领域。其中,Fe₃O₄纳米粒由于具有良好的生物相容性、独特的铁磁性以及光热性能,吸引了越来越多的关注。现已广泛地应用于多个生物领域,如细胞分离、磁共振成像（MRI）、靶向药物递送和光热疗法（PTT）等。普遍认为,氧化铁具有较低的毒性并可体内代谢,同时氧化铁已被批准作为磁共振成像对比剂应用于临床。然而,目前关于氧化铁毒性的研究多是基于10 nm以上的纳米粒开展,10 nm以下纳米粒的毒性研究鲜有报道。同时,研究显示,超小尺寸氧化铁在T₁模式的MRI成像方面具有更好的潜力,因此对其毒性的研究显得尤为迫切。我们在研究中发现,尺寸小于5 nm的超小尺寸超顺磁性氧化铁纳米粒（USPIONs）具有强烈的毒性,在尾静脉注射100mg/kg的剂量下对小鼠具有致命性。相反,尺寸大于5 nm的USPIONs未见明显毒性。本论文对USPIONs的毒理学机制进行研究,提出其毒性机制的假设并予以验证:首先,超小纳米粒（<5 nm）刺激细胞生成多种活性氧簇（ROS）,进而通过细胞内过氧化物酶转变为过氧化氢（H₂O₂）;然后,Fe²⁺通过Fenton反应催化H₂O₂转变为毒性更强的羟基自由基（·OH）,由于·OH不能被体内任何已知的酶清除,因此导致严重体内毒性。具体内容如下:一、通过一缩二乙二醇（DEG）介导的溶剂热反应法合成不同粒径的超小尺寸Fe₃O₄纳米粒,并合成具有相似粒径梯度的SiO₂、Au纳米粒。对合成的Fe₃O₄纳米粒的表征结果显示,所制备的纳米粒具有良好的分散性,粒径分别为2.3 nm、4.2 nm、9.3 nm,外观为近球形。我们研究了不同pH下,不同粒径Fe₃O₄ NPs的Fe²⁺的释放及Fenton反应的速度。结果表明,较小的Fe₃O₄ NPs由于相对较高的比表面积,能够实现Fe²⁺更快的释放,且Fe²⁺的释放具有pH依赖性。在酸性条件下Fe₃O₄ NPs会催化H₂O₂发生Fenton反应产生具有高反应性的·OH,pH=7.4时产生的·OH可以忽略不计。二、不同粒径的Fe₃O₄ NPs的体外生物学效应考察。首先,对纳米粒的细胞摄取行为进行考察。结果表明,粒径<5 nm的纳米粒,包括Fe₃O₄、SiO₂、Au NPs等均可以进入细胞核,而粒径>5 nm的则无法进入。对纳米粒诱导细胞所产生的ROS种类及量进行研究。结果表明,粒径<5 nm的不同种类纳米粒均可以诱导细胞产生ROS,而Fe₃O₄ NPs诱导ROS产生的能力更强。通过对ROS的种类进行检测发现,所有<5 nm的纳米粒（Fe₃O₄、SiO₂、Au）均可以诱导细胞产生O₂^-以及H₂O₂,但是只有Fe₃O₄ NPs可以诱导细胞产生具有强毒性的·OH。细胞毒性实验结果表明,100μM的H₂O₂可使细胞存活率降低至74.3%,但在2.3 nm Fe₃O₄NPs存在时,细胞存活率可进一步降低至42.1%,增强的毒性应归因于·OH的产生。在4.2 nm Fe₃O₄ NPs组中也观察到类似的毒性。三、对不同粒径的Fe₃O₄ NPs的体内行为进行考察。首先,研究了不同粒径及不同种类纳米粒的体内毒性,以100 mg/kg的剂量尾静脉注射至雄性ICR小鼠体内。结果显示,只有2.3 nm、4.2 nm Fe₃O₄ NPs注射组的小鼠发生死亡现象,大粒径Fe₃O₄ NPs及小粒径SiO₂、Au NPs组均未出现死亡。利用电耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定尾静脉注射NPs后,不同器官中的元素浓度。结果显示,体内分布与粒径大小有关,2.3 nm Fe₃O₄ NPs在心脏中有较高分布,而较大粒径的9.3 nm Fe₃O₄ NPs主要分布在肝脏。通过组织匀浆法对器官中的ROS以及高氧化性的·OH进行检测,结果表明,2.3 nm Fe₃O₄组的血清、心脏、肝脏和脾脏中的ROS水平显著增加,分别是对照小鼠的2.16、1.61、4.03和1.90倍,重复注射会导致ROS进一步增加。但只有2.3 nm Fe₃O₄可以显著诱导·OH的产生,注射2.3 nm Fe₃O₄ NPs 2 h后,血清、心脏、肝脏、脾脏和肺中的·OH浓度显著增加,尤其是心脏中的·OH浓度增加了2.56倍。进一步通过H&E染色,可以观察到明显的心脏以及肺部毒性,表现为明显的坏死区域和急性炎症的产生。相比之下,SiO₂和Au NPs组,没有观察到·OH浓度的明显增加,表明·OH只能由Fe₃O₄ NPs诱导生成。以上研究表明,粒径<5 nm的Fe₃O₄ NPs具有强烈的毒性,而粒径>5 nm的Fe₃O₄ NPs及SiO₂和Au NPs未见明显毒性。根据体内及体外实验结果,我们推测超小Fe₃O₄（<5 nm）的毒性由两个步骤引起:超小粒子诱导ROS生成和随后的Fenton反应。除此之外,我们还发现细胞核靶向性以及体内分布均与纳米粒子的粒径有关。这项研究不仅解释了超小Fe₃O₄ NPs的潜在毒理学机理,而且还为超小Fe₃O₄ NPs（<5 nm）的潜在治疗作用提供了依据。