精氨酸在中华绒螯蟹幼蟹和性腺成熟期的营养生理作用

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通过营养调控的方式培育健康、抗病力强的蟹种,以及开发出能够替代冰鲜的高效亲体育肥饲料是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖产业亟待解决的问题。解决这两个问题的关键点是全面、深入地研究营养素在中华绒螯蟹生长、抗逆和性腺发育过程中的生理功能。在中华绒螯蟹营养研究中,有关于氨基酸营养生理的研究颇为缺乏,尤其是氨基酸对亲体育肥阶段的影响和作用近乎空白。而氨基酸是水生动物重要的营养素,在调控动物生长、抗病、抗逆和性腺发育过程中发挥着至关重要的作用。因此,本论文选择虾蟹类关键的限制性氨基酸-精氨酸为研究对象,通过营养学、分子生物学、免疫学及转录组学等研究方法,分别探究精氨酸在蛋白质合成、抗病、抗逆和性腺发育中的作用及精氨酸的应用策略。主要结果及结论如下:1精氨酸对幼蟹蛋白合成的影响在高等动物中,精氨酸调控蛋白质合成的机制已被阐明,然而,在虾蟹类中,精氨酸调控蛋白质合成的通路还未见报道。因此,本论文研究了精氨酸在幼蟹阶段调控蛋白质合成的途径。选用初始体重为0.22±0.03 g的幼蟹分别饲喂精氨酸含量为1.72%(对照组)、2.73%和3.72%的饲料8周。结果表明,精氨酸能够影响血淋巴中蜕皮抑制激素和生长激素的含量,以及肝胰腺中PI3K、Akt、mTOR、S6K1和4EPB1等基因的表达。精氨酸通过影响PI3K-Akt-mTOR信号通路促进了幼蟹蛋白质的合成和沉积。2精氨酸对幼蟹免疫力及抗胁迫能力的影响精氨酸在高等动物和鱼类中调控免疫的途径已经较为明确,然而,精氨酸在甲壳动物中调控免疫及抗逆能力的研究较为滞后。甲壳动物和高等动物免疫系统存在着一定的差异,因此,精氨酸在甲壳动物中如何调控免疫功能的还不是十分清楚。本研究在生长表型的基础上,通过注射脂多糖、Poly(I:C)及嗜水气单胞菌检测免疫指标,探究了精氨酸对中华绒螯蟹免疫性能的影响。结果表明,精氨酸通过上调酚氧化酶原、拟血蓝蛋白、及抗菌肽(甲壳素、溶菌酶)等基因的表达量提高了中华绒螯蟹的免疫力和抗嗜水气单胞菌的感染的能力。当机体遇到环境胁迫时,机体便会产生氧化应激。抗氧化能力是机体应对胁迫能力的一个重要指标。本研究发现精氨酸通过提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性提高了机体的抗氧化能力。为了验证精氨酸是否能够真实的提高中华绒螯蟹的抗应激能力,选择了生产中最易发生的高pH作为胁迫因子检验精氨酸在中华绒螯蟹抗胁迫中的作用。在长期高pH胁迫(9.8)下饲喂精氨酸含量分别为2.37%、3.14%和4.01%的精氨酸饲料8周。结果表明,精氨酸添加组显著提高了实验蟹SOD和CAT的活性,并且下调了脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(LITAF)、金属蛋白酶17(ADAM 17)和p38-丝裂原活化蛋白激酶等炎症相关基因的表达量。表明精氨酸能够通过提高中华绒螯蟹的抗氧化能力,同时降低机体的炎症反应来缓解高pH胁迫。综上,精氨酸能够通过上调免疫基因、抗氧化酶活,并下调炎症基因的表达量提高中华绒螯蟹的免疫力和抗胁迫能力。3氨甲酰谷氨酸(NCG)在幼蟹中的应用研究本研究探究了哺乳动物中常用的促进精氨酸内源性合成的饲料添加剂NCG在中华绒螯蟹中的效果。结果表明,饲料中添加0.04%和0.08%的NCG能够通过促进精氨酸的内源性合成提高高pH胁迫下中华绒螯蟹的生长性能、抗氧化能力、抗炎能力和免疫力。因此,NCG是一种能够促进精氨酸内源性合成并提高中华绒螯蟹抗环境胁迫的饲料添加剂。4精氨酸对雌性亲体生长及卵巢成熟的影响亲体性腺发育期和幼蟹阶段存在较大的生理差异,精氨酸是否还是性腺发育期的关键限制性氨基酸还未知。因此,本论文首先研究了精氨酸对雌性亲体生长和卵巢发育的影响。选用体重为60.05±4.33 g生殖蜕壳前的雌性亲体饲喂精氨酸含量分别为1.83%、2.52%、3.26%、3.96%、4.81%和5.52%的饲料11周。结果表明,适量的精氨酸(2.52%-3.26%)能够提高雌性亲体的增重率和卵巢指数,表明精氨酸是雌性亲体性腺成熟过程中必不可少的氨基酸。随后,又进一步研究了育肥期饲料中适宜的精氨酸添加量,发现在育肥期,卵巢发育所需的精氨酸含量更高,高达4.09%。为了进一步探究精氨酸调控性腺发育的途径,本论文研究了精氨酸对雌性亲体卵黄蛋白原合成、转运及沉积的影响。结果表明,精氨酸能够通过影响卵黄发生抑制激素(VIH)的合成和分泌,进而通过影响第二信使cGMP/cAMP及下游的PKG/PKA促进肝胰腺细胞中卵黄蛋白原基因的表达。此外,精氨酸还能够提高卵巢中卵黄蛋白原受体基因的表达,以此促进卵黄蛋白在卵细胞中的沉积。综上,精氨酸通过促进卵黄蛋白原的合成、转运和在积累促进了卵巢的发育,精氨酸是卵巢发育过程中的必需氨基酸。5精氨酸对雄性亲体生长及蛋白质合成的影响在雄性亲体中,选用平均体重为78.19±8.34 g生殖蜕壳前的雄性亲体饲喂精氨酸含量分别为1.83%、2.52%、3.26%、3.96%、4.81%和5.52%的饲料11周。结果表明,适量的精氨酸(3.26%-3.96%)显著提高了雄性亲体的增重率、肝胰腺指数、副性腺指数和出肉率,表明精氨酸在雄性亲体生长发育过程中发挥着重要的生理功能。随后,又进一步研究了育肥期饲料中适宜的精氨酸添加量,发现在育肥期,副性腺发育所需的精氨酸含量为3.76%。基于生长表型,本研究又进一步探究了精氨酸对雄性亲体蛋白质合成的作用。结果表明,3.26%组肝胰腺和肌肉中mTOR、S6K1、4EBP1等基因均被上调,但是,PI3K和Akt基因没有显著的变化,而GATOR2家族的基因被显著上调,GATOR1家族的基因被显著下调,RagA、RagC、Rheb和Raptor均被显著上调。精氨酸并没有影响PI3K-Akt通路相关基因激活mTOR的,而是通过影响GATOR2、RagA和RagC相关基因将调控信号传递给mTOR进而促进了成蟹肝胰腺肌肉中蛋白质的合成和沉积。6精氨酸对雄性亲体副性腺成熟的影响在雄蟹中,发育成熟的副性腺占整个雄性生殖系统的70%以上,是雄性性腺主要营养物质沉积的地方,关于氨基酸和副性腺发育的研究还未见报道。因此,本研究通过研究精氨酸对副性腺指数的影响及转录组分析,来确定精氨酸在副性腺蛋白合成过程中的生理功能。结果表明,3.26%Arg组显著促进了副性腺的发育,转录组结果表明,精氨酸通过上调副性腺中寡糖基转移酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、乙酰半乳糖基转移酶的表达,促进了糖蛋白的合成代谢,进而促进了中华绒螯蟹雄性亲体副性腺的发育。因此,精氨酸是副性腺发育过程中的必需氨基酸。为了进一步确定副性腺蛋白的合成位点,本研究又通过比较转录组的方法,通过分析调控副性腺糖蛋白合成基因的表达分布,确定了副性腺为副性腺糖蛋白合成的唯一场所。
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