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口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是危害牛、猪、羊等偶蹄动物以及人的一种烈性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。目前预防FMD的最有效措施是接种疫苗,结构蛋白VP1是FMDV最主要的抗原,能够刺激机体产生抗FMDV的中和抗体,在口蹄疫免疫预防的研究中倍受关注,对口蹄疫基因工程疫苗的研制具有重要的意义。白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)具有多种生物学活性,在免疫调节、抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用。因此,IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达,从而加强和改善疫苗的免疫效果。鉴于此,本实验室对山羊白介素18(goat interleukin-18, gIL-18)成熟蛋白基因与VP1基因在昆虫杆状病毒系统中进行了共表达,旨在探索gIL-18对口蹄疫的免疫调节作用,为研制有效的口蹄疫疫苗奠定了基础。根据GenBank上已发表的序列,设计两对引物,分别以pMD18-T-VP1和pET32a-gIL18质粒为模板,扩增山羊白细胞介素18成熟蛋白cDNA基因序列及O型口蹄疫病毒VP1基因序列。再以杆状病毒pFastBac~TM Dual为载体,将VP1基因和gIL-18基因分别插入到双表达载体的P10启动子和多角体蛋白启动子PH的下游,构建重组转移载体质粒pFastBac~TM Dual-gIL18-VP1。然后转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选,用小量法提取杆状病毒重组质粒DNA,在此基础上通过一对通用引物M13(该引物扩增重组质粒Bacmid LacZα区域内的mini-attTn7位点两端的片段,任何外源性基因片段插入pFastBac~TM dual质粒内都会使PCR产物增大)进行PCR扩增,鉴定pFastBac~TM dual- gIL18-VP1质粒克隆到杆状病毒表达载体,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18-VP1。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-gIL18-VP1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9, sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后不同时间收获sf9细胞及培养上清,进行SDS-PAGE电泳、Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测,分析表达情况并对共表达产物进行生物学活性分析。结果表明,用昆虫杆状病毒表达系统成功构建了同时含有gIL-18成熟蛋白基因和O型口蹄疫病毒VP1基因的重组杆状病毒,两者均在昆虫细胞的裂解上清中得到了高效表达,表达的蛋白是可溶性的且具有良好的免疫原性,表达的目的条带分子量分别约为18.3KD和23.5KD。IFA检测显示gIL-18基因和VP1基因同时在同一细胞中独立表达;生物学活性分析表明,适宜浓度的共表达产物能够刺激淋巴细胞增殖、诱导山羊脾淋巴细胞生成IFN-γ抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上生长。从而为下一步研究gIL-18在口蹄疫中的免疫调节作用奠定了坚实的基础。