细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在清除和控制病原体的感染和传播，监视和杀伤肿瘤细胞以及介导免疫排斥反应的发生中起着十分重要的作用。MFICⅠ-肽（pMHCⅠ）四聚体技术因其具有很高的灵敏度和特异性；受检CTL不需体外增殖、无损伤性；能同时直接对特异性CTL进行定性、定量分析和分离纯化等优点而成为抗原特异性T细胞定量的金标准。传统的pMHcⅠ四聚体制备包括以下三个过程：MHCⅠ重链、β2m蛋白的表达和抗原肽的合成；MHCⅠ-肽复合体的制备与纯化；MHCⅠ-肽复合体的生物素化和多聚体的制备。在这三个过程中存在三个技术局限，分别是：①MHCⅠ-肽复合体的制备需要合成抗原肽，步骤繁琐；②复性过程所片j时间较长，复性产量低；⑨基于生物素和链酶亲和素系统的MHCⅠ-肽四聚体法需要生物素化及多聚化过程，试剂昂贵，操作较烦琐，需要后继的纯化与浓缩等步骤。以上技术局限限制了pMHCⅠ四聚体技术在免疫学和分子生物学等研究领域的应用。　　 以上三个技术局限中，有六个具体的问题有待研究和解决：①pMHCⅠ四聚体的技术改进之一是Uger等研究者建立的肽和β2m（β-β2m）融合表达策略制备pMHCⅠ复合体的方法，但在p-β2m重组质粒的构建中其基因第一位核苷酸受插入位点的限制；②重组蛋白能否在大肠杆菌中以可溶性的形式表达；③蛋白鉴定中Western blot实验的仪器化操作；④pMHCⅠ复合体浓缩和纯化简便方法的研究；⑤高效简便复性方法的开发；⑥pMHCⅠ多聚体简便制备方法的研究。　　 本研究选取一段肿瘤抗原肽CEA694-702和一段病毒抗原肽 HBc18-27，采用肽和β2m融合表达的策略制备MHC-CEA694-702和MHC-HBc18-27复合体及其多聚体，并对以上6个方而的问题进行较全面的研究。结果如下：　　 1.所设计的同尾酶酶切-连接策略克服了插入基因序列第一个核苷酸的限制，使构建肽和β2m融合基因更加灵活方便。在p-β2m基因中不含所涉及的酶切位点时，结合不对称酶方法，可以将任意p-β2m基因插入到任意质粒的任意酶切位点中，而没有目的基因起始核苷酸的限制。通过常规酶切-连接方法成功构建了5种重组质粒，分别是：pET32a-Trx-HIS-HC-BSP、pET28a-HC-BMP-HIS、pET28a-HC-HIS、pET28a-CEA694-702-β2m-HIS和pET28a-CEA694-702-β2m；通过同尾酶技术构建成1种重组质粒pET28a-HBc18-27-β2m。这6种重组质粒含有序列正确的目的基因，可以在BL21（DE3）中诱导出相应的蛋白。　　 2.在宿主菌BL21（DE3）中三种MHC重链蛋白（Trx-HIS-HC-BSP、HC-BSP-HIS和HC-BMP-HIS）和两种p-β2m蛋白（CEA694-702-β2m-HIS和CEA694-702-β2m）在各诱导条件下均主要以包涵体形式表达，且诱导条件的不同对胞质可溶性形式表达的目的蛋白的绝对量影响不大。以包涵体形式表达的目的蛋白的量随着诱导时间的增加而增加。采用高压均质法破菌提取包涵体并经初步纯化后，三种MHC重链蛋白（HC-BSP-HIS、HC-BMP-HIS和HC-HIS）的产量在25 mg/L培养基以上，三种p-β2m融合蛋白（CEA694-702-β2m-HIS、CEA694-702-β2m和HBc18-27-β2m）的产量在50 mg/L，培养基以上；六种蛋白的纯度均在85％以上：经Wetern blot鉴定蛋白表达正确。　　 3.所设计并申请专利的蛋白杂交洗脱仪具有节省时间和人力、节省抗体、可规模操作、结果重复性好和杂交效率高等优点，是一种Western blot试验很好的工具。　　 4.运用CEA694-702-β2m-HIS和HBc18-27-β2m蛋白分别制备出结构和构象正确的MHC-CEA694-702复合体和MHC-HBc18-27复合体，与常规的MHC HC、β2m和抗原肽三个单位的复合体制备方法相比，这种肽和β2m融合策略更简便易行，节省成本。利用离子交换色谱同时浓缩和纯化了MHC-HBc18-27复合体，方法快速方便，处理效率高。　　 5.将HC-BSP-HIS和CEA694-702-β2m-HIS同时结合在IMAC色谱上进行复性不能得到纯的MHC-CEA694-702复合体。利用pull-down式复性方法，通过IMAC复性了两种MHC-CEA694-702复合体：MFC-CEA（BSP）和MHC-CEA（BMP），其中MHC-CEA（BSP）复合体通过尺寸排阻色谱、离子交换色谱和反相高效液相色谱三种色谱方法分析结果表明复合体结构正确。进一步，利用我们已申请专利的pull-down式复性方法，通过IEC复性了两种pMHCⅠ复合体：MHC-CEA694-702复合体和MHC-HBc18-27复合体；通过尺寸排阻色谱分析，这两种复合体结构正确，纯度分别为88％和82％；通过Dot-ELISA和FACS进行构象鉴定，结果表明 MHC-CEA694-702复合体构象正确。　　 6.实验发现HC-BMP-HIS可以结合链酶亲和素（SA），并初步表明带BMP-tag的蛋白分子可以在SA的作用下形成多聚体。HC-BSP-HIS蛋白在大肠杆菌中表达时被部分生物素化；在2×YT培养基中培养时HC-BSP-HIS包涵体的产量较高，而在LB培养基中培养时HC-BSP-HIS的生物素化效率较高；当培养基中NaCl浓度为10 mg/mL时，HC-BSP-HIS的包涵体产量和生物素化效率最高；培养基中生物素的浓度对HC-BSP-HIS的包涵体产量和生物素化效率均无明显影响；在37℃和24℃时，HC-BSP-HIS的包涵体的产量均随着诱导时间的增加而增加，其中37℃诱导24 h时包涵体产量最高，而在37℃诱导6 h时HC-BSP-HIS生物素化效率最高，为25％；多聚体形成实验初步表明，部分生物素化的BSP-tag比BMP-tag与SA的多聚化能力要高。通过抗His-tag抗体及PE标记的抗IgG抗体可以将稀释复性法制备的MHC-HBc18-27复合体制备成MHC-HBc18-27多聚体，并能成功地检测到乙型肝炎病毒患者PBM中的HBc18-27-特异性CTL。这种抗体型pMHC多聚体的方法简单，制备方便，是一种具有应用潜力的多聚化方法。pull-down式IEC复性法通过抗体作用形成MHC-HBc18-27多聚体后也可以成功地检测到乙型肝炎病毒患者PBMC中的HBc18-27-特异性CTL，其检测结果与稀释复性法制备的MHC-HBc18-27多聚体检测结果一致，说明pull-down式IEC复性法复性可得到具有功能活性的MHC-HBc18-27复合体。　　 以上结果提示：利用同尾酶技术可以解决p-β2m构建中的基因序列第一个核苷酸的限制，拓宽了肽和β2m融合表达策略的应用范围；pull-down式复性方法可以成功地制备pMHCⅠ复合体，方法简便，复性效率高，复性、浓缩和纯化过程集合在一起；抗体犁多聚体技术是一种简单有效的多聚化方法，可以成功制备出具有功能活性的pMHCⅠ多聚体。这些研究不但简化了肽和β2m融合表达策略下的pMHCⅠ多聚体的构建并提高其制备效率和降低了制备成本，而且为优化常规的pMHCⅠ多聚体制备提供了一定的方法和启示。我们的研究为基于pMHCⅠ复合体及其多聚体基础上的人工抗原递呈细胞和人工抗原递呈芯片的研究提供便利，也为其在基础和临床研究中得到全面应用奠定坚实的基础。