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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)主要是一种组织病理学概念。HF指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积,导致肝结构或(和)功能异常的病理变化。多数慢性肝炎均可发生肝纤维化,部分肝纤维化进一步发展可形成肝硬化和肝癌,严重影响人类健康和生命。而目前临床上尚无理想的抗HF药物,因此能否延缓、终止HF的进展,甚或逆转HF至正常,具有重大意义。HF的形成涉及诸多因素和环节,单纯应用针对某一环节作用的药物可能难以逆转纤维化进程,研究表明,中药复方有多途径,多靶点抗HF的综合药理作用,着眼于肝纤维化发生发展的多个环节,发掘出疗效较好的抗肝纤维化中药复方是中医药工作者的重要使命。雄芍汤乃导师门九章教授治疗肝纤维化的有效验方,本论文中我们一方面进行了雄芍汤抗大鼠免疫性肝纤维化的作用和机理实验研究,另一方面进行了雄芍汤含药血清对体外培养的人肝星状细胞影响的实验研究,简述如下:目的:从症状体征、肝功、肝纤四项、病理形态学等方面综合评价雄芍汤防治免疫性肝纤维化的疗效,并从肝纤维化发病机制中起关键作用的环节入手明确雄芍汤抗肝纤维化的机理。方法:1.动物实验采用猪血清腹腔注射法制造大鼠肝纤维化模型。设立正常对照组、模型组对照组、扶正化瘀胶囊对照组、雄芍汤预防组和雄芍汤高、低剂量组(以下分别简称正常组、模型组、扶正组、雄预组、雄高组、雄低组)。观察大鼠毛色泽、体重等一般情况;肉眼观察大鼠新鲜肝脏的外观;计算肝重与体重的比值,脾重与体重的比值;常规方法检测大鼠血清肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白与球蛋白比值(A/G);同位素放射免疫分析法检测肝纤维化血清标志物:透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨端肽(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CIV)的含量;黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活力,TBA法测定血清MDA含量;ELISA法检测大鼠血清MMP-9、IgE、C3的含量;消化法检测肝组织羟脯氨酸含量;HE染色和Masson染色法观察肝组织病理形态学改变;免疫组织化学染色法检测大鼠肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1表达;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肝组织中TIMP-1mRNA的表达。2.细胞实验采用MTT比色法测定大鼠雄芍汤药物血清对体外培养的人肝星状细胞LX-2增殖的影响;免疫组织化学染色法测LX-2中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1的表达。结果:1.给大鼠腹腔注射猪血清15周后,肝纤维化模型复制成功。2.雄芍汤可以改善免疫性肝纤维化大鼠毛色、进食量和体重等一般情况。3.肝功能指标检测结果:模型组血清AST、ALT、GLB均显著高于正常组(P<0.01),ALB、A/G均显著低于正常组(P<0.01);除了雄低组AST与模型组差别不显著外,雄芍汤各治疗组血清AST、ALT、GLB均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),ALB、A/G均显著高于模型组(P<0.01),雄预组血清GLB显著低于扶正组(P<0.05),雄预组和雄高组A/G显著高于扶正组(P<0.05)。4.血清肝纤维化标志物检测结果:模型组血清HA、LN、PCⅢ、CIV均显著高于正常组(P<0.01),各治疗组血清HA、PCⅢ、LN均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),其中雄高组血清HA和LN显著低于雄预组,且雄高组血清LN显著低于扶正化瘀(P<0.05),雄预组血清CIV显著低于模型组(P<0.05,),而其他治疗组血清CIV与模型组差别不明显。5.肝重指数、脾重指数结果:所有实验组肝重指数均无显著差别;模型组脾重指数明显大于正常组(P<0.01),雄预组和雄低组脾重指数均明显小于模型组(P<0.01),雄高组和扶正组脾重指数均与模型组差别不明显。6.肝组织病理观察结果:模型组大鼠肝组织炎症活动度、纤维化半定量计分均显著高于正常组(P<0.01,);除雄低组外,各治疗组均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),显著高于正常组(P<0.05或P<0.01)。7.肝组织Hyp检测结果:模型组肝组织Hyp含量显著高于正常组(P<0.01),各治疗组均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),雄预组和雄高组均低于扶正组(P<0.05)。8.大鼠血清SOD和MDA含量检测结果:模型组大鼠血清SOD含量显著低于正常组(P<0.01),MDA含量显著高于正常组(P<0.01),除扶正组SOD含量与模型组差别不显著外,各治疗组SOD含量均显著高于模型组(P<0.05或P<0.01),MDA含量均显著低于模型组(P<0.01),其中雄预组SOD含量显著高于雄低组(P<0.05),雄低组显著高于雄高组,各治疗组间MDA含量差别不显著。9.大鼠血清IgE、C3的含量检测结果:模型组大鼠血清IgE、补体C3均与正常组差别不显著,雄预组IgE显著高于其他所有组(P<0.05或P<0.01),雄预组补体C3显著低于正常组和模型组。10.大鼠肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1表达免疫组织化学染色结果:模型组大鼠肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1含量显著高于正常组(P<0.01),各治疗组均显著低于模型组(P<0.01),各治疗组中雄预组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA含量显著低于扶正组(P<0.05或P<0.01),雄高组Ⅲ型胶原含量也显著低于扶正组(P<0.01),雄高组和雄预组Ⅲ型胶原、α-SMA含量均显著低于雄低组(P<0.01)雄低组TGF-β1表达显著低于雄高组(P<0.01)。11.大鼠血清MMP-9含量和肝组织TIMP-1mRNA表达检测结果:模型组大鼠血清MMP-9含量显著低于正常组(P<0.05),肝组织TIMP-1mRNA表达显著高于正常组(P<0.01);雄预组血清MMP-9含量显著高于模型组(P<0.01),其他用药组与模型组差别不显著;雄高组肝组织TIMP-1mRNA表达显著低于模型组(P<0.01),与正常组差别不显著。12.雄芍汤含药血清对LX-2增殖的抑制率结果:20%和10%空白血清组抑制率均低于相应浓度的扶正组和雄芍汤组(P<0.01),5%空白血清组抑制率与相应浓度的扶正组和雄芍汤组差别不显著;雄芍汤各浓度含药血清组对LX-2增殖的抑制率显著高于相应浓度的扶正含药血清组(P<0.05或P<0.01)。雄芍汤各浓度含药血清组中,20%组和10%组对LX-2增殖的抑制率差别不显著,但均显著高于雄芍汤5%组(P<0.01)。13.含药血清对LX-2中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1的表达影响的免疫组织化学染色结果:雄芍血清组和扶正血清组LX-2中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA和TGF-β1含量显著低于空白血清组(P<0.01),雄芍血清组和扶正血清组Ⅰ型胶原差别不显著,扶正血清组Ⅲ型胶原、α-SMA含量显著低于雄芍血清组(P<0.05),雄芍血清组TGF-β1含量显著低于扶正血清组(P<0.01)。结论:1.雄芍汤有确切的抗免疫性肝纤维化疗效,早期预防用药综合疗效较好,其抗肝纤维化的机理与扶正化瘀胶囊不完全相同,且在一定条件下某些方面的抗肝纤维化疗效优于扶正化瘀胶囊。2.雄芍汤抗肝纤维化的作用机理主要有如下几方面2.1保护肝细胞,改善肝功能的作用。2.2既抑制胶原等ECM的合成,又促进其降解。2.3提高肝纤维化大鼠清除氧自由基和抑制脂质过氧化能力2.4调节免疫功能2.5促进MMP生成,抑制TIMP-1mRNA表达,从而促进ECM降解2.6抑制HSC活化和增殖,减少促纤维化细胞因子的生成