研究背景变应性鼻炎是指特应性个体与过敏原发生接触后,由IgE介导的介质释放以及多种免疫活性细胞及细胞因子等参与的鼻黏膜非感染性炎性疾病,全球人口中发病率大约为10%～20%。近年来,变应性鼻炎的发病率在世界范围内正逐年升高。变应性鼻炎从属于系统性炎症疾病,并且与其他炎症紊乱相关,例如:哮喘、鼻窦炎和过敏性结膜炎。变应性鼻炎能够降低患者的生活质量,它可以对患者的睡眠、学业、工作生产力以及社交生活均产生一定影响。由于其较高的发病率以及对生活质量产生的不良影响,变应性鼻炎已经被划分为一种慢性呼吸道疾病。变应性鼻炎不仅给患者造成沉重的经济负担,也加重了国家医保的财务负担,与常见的冠心病、糖尿病和哮喘等疾病相比,需要更多的资金投入。目前已经有针对变应性鼻炎的诊疗指南供医生和患者参考。但是,许多变应性鼻炎患者并没有寻求基层医疗医生或者专家的帮助,而是选择自我治疗甚至直接忽视它。因此,医生在识别和诊断变应性鼻炎症状时,应该仔细询问患者的发病史以及以往的用药情况,方便为后续治疗提供参考。目前,变应性鼻炎的常规疗法包括避免过敏原接触,生理盐水冲洗鼻腔,口服抗组胺药,鼻喷激素,联合鼻喷激素与抗组胺类鼻喷雾剂,白三烯受体拮抗剂和过敏原免疫疗法。在部分患者中,其他疗法可能亦起到良好的治疗效果,包括使用减充血剂和口服激素。但是这些药物仅在短期内缓解变应性鼻炎的症状,而且不可避免的副作用限制了它们在临床上的长期应用。因此,迫切需要开发靶向变应性鼻炎发病机理的新型治疗剂,其应具有低副作用或者对过敏原避免的依从性。众所周知,miRNA参与许多生物过程,如细胞分化、免疫防御和细胞凋亡。近年来,MiR-146a已成为炎症性疾病研究领域的热点之一,具有强效和广泛的抗炎作用。有人发现在接受过敏原特异免疫疗法治疗的变应性鼻炎儿童患者中,MiR-146a表达水平上调。并且MiR-146a在调节性T细胞表面高表达,当效应性T细胞和髓系细胞激活时,能够诱导MiR-146a的表达。MiR-146a主要是通过TRAF6和IRAK1/2介导的炎症反应进行负反馈调节,从而参与到过敏原特异免疫疗法中。引人注目的是,有文献报道MiR-146a通过抑制类风湿性关节炎中的TLR4/TRAF6/NF-κB信号传导来抑制炎症反应。他们还发现,针对变应性鼻炎MiR-146a可能具有治疗潜力,但其在变应性鼻炎中发挥抗炎作用的具体机制尚未阐明。目的1.在炎症相关疾病中,MiR-146a已显示具有效果显著的抗炎作用。本研究旨在探究MiR-146a在变应性鼻炎患者中的表达情况以及其对患者炎症的影响。2.探讨MiR-146a是否通过影响TRAF6/NF-κB信号通路来干预变应性鼻炎。3.探讨MiR-146a在变应性鼻炎小鼠模型中是否也能发挥治疗潜力及其发挥抗炎作用的潜在机制。方法1.利用逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质印迹的方法检测单纯鼻中隔偏曲患者和变应性鼻炎患者以及三组小鼠鼻黏膜组织中MiR-146a、TRAF6等相关分子的RNA、mRNA和蛋白表达水平。2.利用免疫组化检测单纯鼻中隔偏曲患者和变应性鼻炎患者中TRAF6的表达情况。3.体外培养变应性鼻炎患者鼻黏膜组织,使用不同浓度MiR-146a类似物干预处理,通过蛋白免疫印迹方法检测体外鼻黏膜组织中TRAF6/NF-KB信号传导途径的关键分子的蛋白表达水平。4.将雌性小鼠随机分成三组实验组,即变应性鼻炎组,对照组和MiR-146a组。利用卵清白蛋白刺激小鼠建立变应性鼻炎小鼠模型。对于变应性鼻炎组小鼠,在第0、7和14天,通过腹腔注射100μl含有100μg卵清蛋白和2mg氢氧化铝的生理盐水使小鼠致敏。然后在第21-28天内每天用卵清白蛋白溶液(溶解在生理盐水中的浓度为40mg/ml,20μl/小鼠)刺激小鼠鼻腔。对于对照组,正常注射含有氢氧化铝而不含卵清蛋白的等量的生理盐水溶液,然后在第21-28天用生理盐水代替卵清白蛋白溶液刺激小鼠鼻腔。对于MiR-146a组,在第0、7和14天,通过腹腔注射100 μl含有100 μg卵清蛋白和2 mg氢氧化铝的生理盐水使小鼠致敏,然后在第21-28天内每天用卵清白蛋白溶液刺激鼻腔前30分钟,鼻内给予MiR-146a类似物(溶解在生理盐水中的浓度为0.1 mg/ml,20 μl/小鼠)。在第28天记录所有小鼠的打喷嚏频率和鼻部摩擦事件的数量,记录过程持续10分钟。在最后一次刺激小鼠鼻腔2小时后,在小鼠麻醉的情况下,收集每只小鼠的血液和鼻腔灌洗液,用于后续的分析。5.利用酶联吸附试验检测血清中相关蛋白的浓度,包括卵清白蛋白特异性的IgE、白三烯C4、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、白细胞介素-2、IL-4、IL-5和IL-13和干扰素-γ的水平。6.利用血球计数器对三组小鼠鼻腔灌洗液中的白细胞总数进行计数。通过Wright’s-Giemsa测定法对嗜酸性粒细胞,嗜中性粒细胞和淋巴细胞进行染色,并进行细胞计数。结果1.(1)与单纯鼻中隔偏曲患者相比,变应性鼻炎患者的MiR-146a的RNA水平显著下调。并且MiR-146a下游靶基因TRAF6在变应性鼻炎患者中的mRNA和蛋白水平都显著上调。(2)HE染色结果显示,单纯鼻中隔偏曲患者的鼻黏膜组织结构相对正常,但是变应性鼻炎患者染色显示大量的炎症细胞浸润。并且免疫组化结果显示TRAF6在变应性鼻炎患者中显著升高。(3)与单纯鼻中隔偏曲患者相比,变应性鼻炎患者血清中炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的水平都显著升高。2.与未处理相比,MiR-146a类似物处理之后,变应性鼻炎患者的体外鼻黏膜组织中TRAF6的蛋白表达水平下降;p-IκBα的蛋白水平显著下调;IκBα的蛋白水平显著升高;p65的蛋白水平下降。并且,这些蛋白的变化水平具有MiR-146a类似物浓度依赖性。3.(1)HE染色结果显示,变应性鼻炎小鼠鼻黏膜相对于正常对照组可见腺上皮水肿、黏膜下腺体增生;经MiR-146a类似物干预后的变应性鼻炎小鼠鼻黏膜腺上皮水肿减轻、腺体增生减弱。(2)与对照组相比,变应性鼻炎小鼠组鼻黏膜中MiR-146a的RNA表达水平显著下调(P=0.002)。并且作为MiR-146a的下游靶基因TRAF6,与对照组相比,在变应性鼻炎小鼠组中鼻黏膜组织中的mRNA水平(P=0.004)和蛋白水平(P<0.01)都显著增加。(3)与对照组相比,未接受治疗的变应性鼻炎小鼠患有严重的打喷嚏和流鼻涕症状(P<0.01),对照组小鼠10分钟内打喷嚏的平均次数为11.50次,但是未接受治疗的变应性鼻炎小鼠10分钟打喷嚏的平均次数为56.75次。而在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠打喷嚏的次数显著降低(P=0.007),10分钟内打喷嚏的平均次数降为35.5次。(4)对照组小鼠10分钟鼻部摩擦的平均次数为14次,未接受治疗的变应性鼻炎小鼠10分钟内鼻部摩擦的平均次数为62.25次,未接受治疗的变应性鼻炎小鼠鼻部摩擦的次数显著多于对照组小鼠(P<0.01)。而在接受MiR-146a类似物治疗后,变应性鼻炎小鼠鼻部摩擦的次数显著降低(P=0.0013),10分钟内鼻部摩擦的平均次数为41.25次。(5)在对照组小鼠的血清中卵清白蛋白特异性IgE的平均含量为0.1833pg/ml,而未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组中的含量为0.5133pg/ml,显著高于对照组小鼠(P=0.0381)。在接受MiR-146a类似物治疗后,变应性鼻炎小鼠组中卵清白蛋白特异性IgE的平均含量为0.3233pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。对于血清中的白三烯C4,对照组小鼠中的平均含量为129.8pg/ml,未接受治疗的变应性鼻炎小鼠中的平均含量为239.8pg/ml,显著高于对照组小鼠(P=0.0094)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠组中白三烯C4的平均含量降为159.7pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。对于血清中的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白,对照组小鼠的平均含量为156.4pg/ml,未接受治疗的变应性鼻炎小鼠的平均含量为589.8pg/ml,显著高于对照组小鼠(P<0.01)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠组中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的平均含量为276.3pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。(6)对照组小鼠鼻腔灌洗液中的嗜酸性粒细胞的平均数目为5.43×106个/ml,变应性鼻炎小鼠的平均数目为26.16×106个/ml,显著高于对照组(P=0.0009)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,嗜酸性粒细胞的平均数目为16.83×106个/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。对于鼻腔灌洗液中的白细胞,对照组小鼠的平均数目为10.6×106个/ml,变应性鼻炎小鼠的平均数目为54.49×106个/ml,显著高于对照组(P<0.01)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠的鼻腔灌洗液中的白细胞平均数目为27.66×106个/ml,显著低于未治疗的变应性鼻炎小鼠(P=0.0006)。对于鼻腔灌洗液中的淋巴细胞,对照组小鼠的平均数目为3.273×106个/ml,变应性鼻炎小鼠的平均数目为15.83×106个/ml,显著高于对照组(P=0.0002)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠的鼻腔灌洗液中的淋巴细胞平均数目为9.618×106个/ml,显著低于未治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。对于鼻腔灌洗液中的中性粒细胞,对照组小鼠的平均数目为1.773×106个/ml,变应性鼻炎小鼠的平均数目为12.50×106个/ml,显著高于对照组(P<0.01)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠的鼻腔灌洗液中的淋巴细胞平均数目为8.118×106个/ml,显著低于未治疗的变应性鼻炎小鼠(P<0.01)。(7)对照组小鼠血清IL-4的平均水平为23.82pg/ml,变应性鼻炎小鼠血清IL-4的平均水平为116.8pg/ml,显著高于对照组(P=0.0063)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠血清IL-4的平均水平为55.52pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组。对于血清中的IL-5,对照组小鼠的平均水平为31.15pg/ml,变应性鼻炎小鼠的平均水平为250.1pg/ml,显著高于对照组(P=0.0038)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠血清IL-5的平均水平为122.2pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组。对于血清中的IL-13,对照组小鼠的平均水平为37.82pg/ml,变应性鼻炎小鼠的平均水平为183.5pg/ml,显著高于对照组(P=0.0228)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠血清IL-5的平均水平为88.85pg/ml,显著低于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组。(8)对照组小鼠血清IL-2的平均水平为411.6pg/ml,变应性鼻炎小鼠血清IL-2的平均水平为203.6pg/ml,显著低于对照组(P<0.01)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠血清IL-2的平均水平为289.8pg/ml,显著高于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组。对于血清中的IFN-γ,对照组小鼠的平均水平为53.27pg/ml,变应性鼻炎小鼠的平均水平为20.30pg/ml,显著低于对照组(P=0.0002)。在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠血清IFN-γ的平均水平为35.11pg/ml,显著高于未接受治疗的变应性鼻炎小鼠组。(9)与对照组相比,变应性鼻炎小鼠的鼻黏膜中TLR4及其下游分子TRAF6的蛋白表达水平显著增加。而在接受MiR-146a类似物处理之后,变应性鼻炎小鼠中这两个蛋白的表达水平都显著下调。此外,NF-κB在变应性鼻炎小鼠组中都显著活化,与对照组相比,细胞质中p-IκBα与IκBα比率和细胞核中p65的蛋白表达水平都显著升高。同样的,在接受MiR-146a类似物治疗之后,变应性鼻炎小鼠中细胞质中p-IκBα与IκBα比率和细胞核中p65的蛋白表达水平都显著下调。结论1.本研究发现MiR-146a在变应性鼻炎患者中的RNA水平显著下调,以及它下游的靶基因TRAF6的mRNA和蛋白水平显著上调。并且在变应性鼻炎患者中炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的水平显著增高。2.用MiR-146a类似物处理体外培养鼻黏膜组织之后TRAF6/NF-κB信号通路受到影响。因此,本研究表明在变应性鼻炎患者中可能通过下调MiR-146a的表达影响TRAF6/NF-κB信号通路,从而促进炎症的发生。3.本研究发现在变应性鼻炎小鼠中MiR-146a的RNA水平显著下调,以及它下游的靶基因TRAF6的mRNA和蛋白水平显著上调。MiR-146a类似物可以减轻变应性鼻炎小鼠的过敏症状。并且,MiR-146a类似物可以减少血清中卵清白蛋白特异性IgE的产生,减少炎症细胞的数目。此外,MiR-146a类似物可以一定程度上调节变应性鼻炎小鼠中Th1/Th2细胞失衡,从而影响炎症因子的表达。机制上,本论文发现MiR-146a对变应性鼻炎的抗炎作用可能在一定程度上通过抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路发挥作用。因此,MiR-146a可被认为未来是变应性鼻炎的潜在治疗靶点。