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目的:1.对广藿香不同组织进行挥发性成分及代谢组研究,反映广藿香不同组织的代谢网络差异。2.对广藿香叶片响应茉莉酸甲酯诱导的蛋白差异及挥发性代谢物进行研究,探讨茉莉酸甲酯对广藿香叶片诱导后次生代谢及其蛋白表达水平的变化规律。3.基于蛋白质谱鉴定方法,利用DNA Pull-Down技术筛选得到PatPTS和PatFPPS启动子结合蛋白,挖掘PatPTS和PatFPPS启动子潜在调控因子;利用GSTPull-Down技术得到PatPTS和PatFPPS的互作蛋白,初步筛选分析可能与之相互结合的蛋白,以期为下一步在转录和翻译调控机制研究奠定基础。方法:1.利用GC-MS和LC-MS方法;对广藿香花、茎、叶三种组织进行检测,使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA),倍数变化分析(FCA),T检验和层次聚类的方法来分析次级代谢的差异。2.在茉莉酸甲酯诱导下,利用GC-MS分析广藿香叶片的广藿香醇等重要代谢物成分,利用iTRAQ技术方法分析其蛋白组响应,将质谱数据与谱库检索后进行详细的注释,筛选差异表达蛋白,从Gene Ontology(GO)、蛋白结构域、KEGG通路和亚细胞定位、蛋白复合物等方面进行分析。3.提取茉莉酸甲酯诱导下的广藿香叶片核蛋白及总蛋白,设计广藿香萜类合成酶PatPTS及PatFPPS启动子的链生物素引物,PCR大量扩增链生物素启动子片段并回收,将广藿香核蛋白与链生物素启动子孵育,利用DNAPull-Down技术进行结合和洗脱,从而得到启动子结合蛋白,并利用质谱技术进行鉴定。通过克隆将PatPTS和PatFPPS连接到PGEX-6P-1载体,得到融合基因的克隆菌株,提取质粒转化表达菌株,诱导表达蛋白,得到带有GST标签的PatPTS和PatFPPS融合蛋白,与广藿香叶片总蛋白进行体外孵育进行互作蛋白下拉,钓取的结合蛋白经SDS-PAGE,胶内消化回收蛋白并通过质谱鉴定蛋白。结果:1.在本研究中,使用GC-MS从广藿香的地上部分中鉴定出23种挥发性化合物,其中多数是倍半萜烯。广藿香醇含量在叶组织中最高,而在茎和花组织中低得多。使用UHPLC-QTOF-MS,我们分析了花、叶和茎组织的化学成分,花和叶组织之间存在最大程度的代谢物变异。花和叶、花和茎、叶和茎的成对比较后分别得到112,77和83种不同代谢物,并鉴定了代谢物生物标志物,注释分析这些差异代谢物的相关信号通路。分析结果发现花朵积累了更多的脂质和氨基酸,包括脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和色氨酸;叶片中积累了更高水平的萜类化合物,维生素和类黄酮;发现茎组织含有较高水平的嘌呤化合物和碳水化合物。2.对广藿香苗期MeJA诱导处理后,利用GC-MS分析发现MeJA诱导后广藿香醇及其他倍半萜烯类化合物含量均有不同程度的升高。利用LC-MS分析其蛋白组,发现广藿香经MeJA处理后,共得到254个显著性差异的蛋白,其中显著上调的蛋白有140个,显著下调的蛋白有114个。KEGG通路分析后,上调差异蛋白主要富集在光合作用和光合作用-天线蛋白两条通路,下调蛋白显著富集在萜类骨架生物合成、硫胺素代谢、昼夜节律-植物、黄酮类生物合成和次生代谢产物的生物合成五条通路上。254个显著性差异的蛋白显示广藿香在MeJA诱导下,光合作用、萜类合成代谢及防御反应发生较为显著的变化。3.利用DNAPull-Down,钓取广藿香核蛋白提取物中的PatPTS和PatFPPS启动子结合蛋白,从结果中共筛选出12个候选结合蛋白。其中酵母单杂交验证结果表明 9592 basic helix-loop-helix transcription factor(9592bHLH)和 zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 2-like(BED-R)在广藿香中的同源蛋白与PatPTS启动子有结合活性。GST Pull-Down技术则初步筛选得到与PatPTS和PatFPPS相互作用的蛋白。结论:1.研究了广藿香不同组织中代谢物的积累和交流,为广藿香中代谢物的探索和代谢调控提供了潜在的代谢途径网络。2.MeJA诱导下能提高广藿香萜类化合物—广藿香醇的含量。MeJA能影响广藿香的光合作用、萜类合成代谢及防御反应,为揭示其潜在分子机制提供一定参考。3.研究初步得到广藿香PatPTS和PatFPPSS启动子潜在结合蛋白,及PatPTS和PatFPPS两个萜类合酶的潜在互作蛋白,为下一步研究提供参考。