论文部分内容阅读
研究目的1.通过检测人体黑色素瘤组织标本中基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达水平,探讨MMP-13与恶性黑色素瘤多个临床病理学参数之间的相关关系,阐明MMP-13对恶性黑色素瘤生物学行为如肿瘤转移及患者预后的影响及其作用。通过观察并分析人体黑色素瘤组织标本中MMP-13的表达与肿瘤血管生成拟态、马赛克血管及内皮依赖性血管数目的关系,探讨MMP-13对黑色素瘤血液供应模式的影响。同时在体外三维细胞培养模型中观察MMP-13对黑色素瘤细胞及内皮细胞管道形成能力的影响。此外,通过小鼠黑色素移植瘤模型观察MMP-13在肿瘤不同生长阶段的的表达水平及其与肿瘤不同血液供应模式的相关性。2.分析MMP-13对层粘连蛋白-5的降解片段对黑色素瘤细胞管道形成能力的作用,探索MMP-13对黑色素瘤血管生成拟态形成影响的可能机制。通过检测黑色素瘤组织和黑色素瘤细胞的血管生成拟态标志分子即VE-cadherin的表达水平,寻找MMP-13对黑色素瘤血管生成拟态的影响的可能分子机制及相关信号通路。同时观察MMP-13对内皮细胞运动能力的影响,探讨MMP-13对内皮依赖性血管生成影响的可能机制。3.通过检测黑色素瘤组织中VE-cadherin及β-catenin的表达水平,分析MMP-13在肿瘤细胞的表达与VE-cadherin及β-catenin的关系及临床病理意义。研究方法1.应用免疫组织化学染色方法检测并分析79例人体恶性黑色素瘤组织中肿瘤细胞MMP-13的表达水平、血管生成拟态,马赛克血管及内皮依赖性血管数目以及恶性黑色素瘤组织的一般临床病理学特征,对肿瘤细胞MMP-13的表达水平与恶性黑色素瘤临床病理参数之间的相关关系进行统计学分析。同时进一步分析MMP-13在黑色素瘤组织中肿瘤细胞内的表达水平与黑色素瘤患者生存及预后的关系。此外,通过免疫组织化学方法检测黑色素瘤组织中VE-cadherin及β-catenin的表达水平,分析MMP-13在肿瘤细胞的表达与VE-cadherin及β-catenin的关系及意义。2.体外培养黑色素瘤A375和B16-F10细胞系,利用质粒转染方法建立稳定转染pcDNA-3-MMP-13和pRNAT-MMP-13 siRNA的黑色素瘤细胞系,通过体外细胞三维培养实验观察上调和下调MMP-13的表达水平后肿瘤细胞的管道形成能力的变化。同时体外培养HUVEC脐静脉内皮细胞,观察MMP-13对其迁移能力以及管道形成数目的影响。3.建立小鼠黑色素移植瘤模型,观察肿瘤组织中MMP-13的表达与肿瘤生长时间的关系及其与肿瘤血液供应模式的相关性。4.利用western-blotting技术检测MMP-13对层粘连蛋白-5的降解片段,同时利用细胞三维培养实验观察并分析后者对黑色素瘤细胞管道形成能力的影响。此外,通过western-blotting检测肿瘤细胞在不同MMP-13的表达水平时VE-cadherin的变化;利用免疫荧光技术观察并分析外源性MMP-13对黑色素瘤细胞中β-catenin的表达及其分布的影响。研究结果1.79例恶性黑色素瘤组织中,肿瘤细胞呈MMP-13高表达的有36例,MMP-13呈低表达的有43例。MMP-13的表达水平与肿瘤的转移、Breslow分级及肿瘤直径呈正相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示,黑色素瘤组织中肿瘤细胞内MMP-13呈高表达的患者总生存时间明显低于MMP-13低表达者,差异有统计学意义(P<0.05)。2.MMP-13呈高表达的肿瘤组织中血管生成拟态的数目较少,MMP-13呈低表达的肿瘤组织中血管生成拟态的数目较多,差异具有统计学意义(P<0.05);与MMP-13呈低表达的黑色素瘤组织相比,MMP-13呈高表达的肿瘤组织中微血管密度较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。在体外细胞培养模型中,上调MMP-13的表达水平后,黑色素瘤细胞在体外三维培养中的管道形成能力减弱;而下调MMP-13的表达水平后,肿瘤细胞的管道形成能力增强。此外,将过表达MMP-13的A375黑色素瘤细胞的培养基用于脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养,内皮细胞在三维培养基中形成的管道数目明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.MMP-13在黑色素移植瘤中的表达呈现时间依赖性趋势,随着肿瘤的生长,MMP-13在肿瘤细胞中的表达逐渐升高,且移植瘤中MMP-13的表达与血管生成拟态的数目呈负相关,而与微血管数目呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.MMP-13将层粘连蛋白-5降解成分子量较小的降解片段,后者可以抑制肿瘤细胞体外形成管道的能力。5.Transwell侵袭实验结果表明,MMP-13可以促进内皮细胞的运动能力,其作用大于MMP-2对内皮细胞运动能力的促进作用。6.MMP-13呈高表达的黑色素瘤组织中肿瘤细胞的VE-cadherin表达水平较低,β-catenin的细胞膜阳性表达水平也较低,而β-catenin的细胞浆及细胞核的阳性表达率较高,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞培养基中加入外源性的MMP-13重组蛋白可以降低黑色素瘤细胞VE-cadherin的表达水平,而细胞培养上清中则可以检测到较小分子量的VE-cadherin。与此同时,β-catenin的细胞膜阳性表达水平较低,而细胞浆及细胞核的阳性表达水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.MMP-13可促进黑色素瘤的转移,MMP-13在肿瘤细胞内呈高表达提示患者预后不良。2.MMP-13在黑色素瘤的血液供应模式的调控中起到重要作用,可对肿瘤血管生成拟态的形成起到负向调控的作用,而对肿瘤内皮依赖性血管的生成起到正向调控作用。3.MMP-13可能在肿瘤生长的晚期阶段通过促进内皮依赖性血管取代血管生成拟态从而使之成为肿瘤内的主要微循环模式。4.MMP-13可能通过对层粘连蛋白-5和血管生成拟态形成的标志蛋白VE-cadherin的降解作用而抑制肿瘤血管生成拟态的形成。5.MMP-13可通过对内皮细胞在细胞外基质的运动能力的促进作用而促进内皮依赖性血管生成。6.MMP-13可将VE-cadherin降解成小片段,从而促进β-catenin从VE-cadherin/β-catenin复合物中释放并在细胞浆和细胞核内积聚,后者可以促进黑色素瘤的转移。