研究背景与研究目的黄热病病毒（yellow fever virus,YFV）是一种蚊媒传播的黄病毒,其引起的黄热病（yellow fever,YF）主要在非洲和南美洲等热带地区流行。接种疫苗和防蚊灭蚊可显著降低YF发病率。然而,在高风险地区,疫苗覆盖率低,且存在大量难以管控的传播媒介,使YF在这些国家出现周期性暴发。目前,尚无特异性治疗药物,YF患者病死率可高达30%。随着经济全球化进程,世界各国之间的交流日益频繁,YF输入性传播的风险也随之增加。近年来,受气候变化的影响,我国南方地区已存在可传播YFV的埃及伊蚊。由于我国民众普遍对YFV缺乏免疫力,输入性病例极有可能导致大面积传播,将严重危害人民生命健康,影响经济发展和社会稳定。因此,重视YFV感染机制的研究以及抗病毒药物的研发具有十分重要的现实意义。YFV感染是一个高度有序的复杂过程,这也为抗病毒药物研发提供了许多靶点。细胞入侵是病毒生命周期的起始阶段,此时病毒基因组尚未释放,干扰YFV入侵的药物可同时具有预防和治疗作用。病毒复制是整个感染周期的关键环节,影响病毒生命周期的速率,靶向病毒复制的药物可显著降低YFV的感染,具有重要的临床应用价值。已有研究表明,针对YFV入侵或复制的药物在体内外实验中均具有较好的抗病毒活性,但其在人体中的效果和安全性尚不确定,难以在短时间内运用于临床。本课题中,我们通过对FDA批准的小分子化合物库的高通量筛选,发现临床抗结核药物利福喷汀（rifapentine）具有显著的抗YFV活性。在此基础上,我们利用YFV体外感染研究平台,明确了利福喷汀抗YFV的作用靶点和具体机制;同时通过YFV动物感染模型,评价了利福喷汀体内的抗病毒活性,为利福喷汀治疗YF患者的临床应用提供了坚实的理论基础和实验依据。研究方法1.利用YFV的细胞感染模型,检测利福喷汀抗YFV活性及其细胞毒性。2.设计药物作用时间窗实验,初步确定利福喷汀抑制YFV感染的起效阶段。3.蔗糖密度梯度超速离心法去除与YFV颗粒孵育的利福喷汀,检测药物对病毒颗粒感染性的影响。4.利用病毒结合实验、入侵动力学实验、内吞实验、病毒-细胞膜融合动态监测实验检测利福喷汀对病毒入侵不同阶段的影响。5.构建带有Nano Luc?荧光素酶报告基因的病毒复制子,检测利福喷汀对YFV基因组RNA复制的影响;体外表达YFV非结构蛋白5（NS5）及其RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,Rd Rp）亚基,利用Biacore检测利福喷汀是否通过结合YFV复制的关键蛋白抑制病毒的复制;计算机模拟利福喷汀和Rd Rp的空间结构,通过分子对接预测利福喷汀与Rd Rp的作用部位。6.将构建的病毒表达质粒转染入靶细胞,收集细胞内外病毒颗粒,用以评价利福喷汀对成熟病毒颗粒包装、释放的影响。7.经腹腔注射途径分别感染Ⅰ型干扰素受体缺陷小鼠(A129-/-)和野生型C57BL/6小鼠（WT-C57BL/6）,观察小鼠体重变化和生存情况,确定建立YFV小鼠感染模型的最佳条件;灌胃法给予利福喷汀,通过生存分析、症状观察、组织的免疫荧光和免疫组化、组织匀浆液中病毒滴度检测以及组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,检测利福喷汀体内抗YFV活性。研究结果1.利福霉素类化合物中的利福喷汀细胞毒性小,抗YFV活性显著,其半数细胞毒性浓度(50%cytotoxic concentration,CC50)、半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)分别为147.3μM和0.562μM。除对西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）有较低的抑制作用外,对其他黄病毒无效。2.利福喷汀不直接作用于病毒颗粒影响其感染性。3.在病毒入侵阶段,利福喷汀抑制YFV与靶细胞的结合过程,但不影响YFV的内吞和膜融合过程。4.通过复制子检测、Biacore分析和分子对接预测,发现利福喷汀可能通过与YFV Rd Rp亚基的活性中心相互作用,影响其活性,从而抑制病毒基因组的复制。5.利福喷汀不影响YFV颗粒的包装与释放。6.利福喷汀可显著提高YFV感染的A129-/-小鼠和WT-C57BL/6小鼠生存率、改善临床症状、减轻组织损伤,并降低组织中病毒载量和病毒蛋白的表达。结论本研究发现,利福喷汀具有显著的抗YFV活性。体外实验证实,在YFV感染早期,利福喷汀可抑制病毒与靶细胞的结合;在YFV感染中晚期,利福喷汀通过与YFV Rd Rp相互作用抑制病毒基因组RNA的复制。体内实验显示,利福喷汀可显著提高YFV感染的A129-/-小鼠和WT-C57BL/6小鼠的生存率,减轻其组织损伤并降低组织中病毒载量和病毒蛋白的表达。这表明利福喷汀是一个有效的抗YFV候选药物,值得进一步深入探索和研究。