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研究背景:细胞内中性脂质蓄积是动脉粥样硬化泡沫细胞形成的主要生化改变。在真核细胞中,细胞内多余的脂质以脂滴的形式贮存于胞浆中。Adipophilin就是脂滴外周40余种相关蛋白中含量较高的一种,其功能主要是促进细胞内脂质的蓄积。酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase, ACAT)是细胞内主要的合成胆固醇酯的酶。它催化游离胆固醇和长链脂肪酸形成胆固醇酯,从而影响细胞内脂质的积聚。二者在亚细胞定位及功能上的相似性以及本实验室以前的研究提示两者之间关系密切,但是,两者之间作用的机制尚不清楚。目的:通过建立高表达adipophilin基因的RAW264.7细胞株,观察高表达adipophilin细胞内ACAT1表达的变化,探讨adipophilin是否通过PKC信号途径作用于ACAT1,阐明adipophilin促进泡沫细胞形成的机制。方法:构建pQCXIP-HA-Adi逆转录病毒载体,并用酶切和PCR鉴定。将该重组质粒用梭华-Sofast基因转染试剂转染PA317包装细胞,获得pQCXIP-HA-Adi逆转录病毒。再用病毒感染RAW264.7细胞,Puromycin筛选,获得稳定高表达adipophilin的RAW264.7细胞株。应用RT-PCR和Western Blot检测经感染后细胞内adipophilin和ACAT1的表达。并应用Atorvastatin和PKC抑制剂Calphostin C分别处理高表达adipophilin基因的RAW264.7细胞,观察ACAT1表达的改变。结果:酶切和PCR反应结果显示pQCXIP-HA-Adi逆转录病毒载体构建成功。转染PA317细胞后病毒释放,用病毒感染RAW264.7细胞,经RT-PCR和Western Blot检测证实RAW264.7细胞中adipophilin mRNA和蛋白表达明显升高。pQCXIP-HA-Adi转染组ACAT1 mRNA和蛋白表达明显增高,空载体pQCXIP转染组ACAT1的表达无明显变化。加入Atorvastatin之后,即在去除底物对ACAT1表达影响的情况下,PQCXIP-HA-Adi转染组ACAT1表达仍升高。当细胞加入OxLDL或者不加OxLDL的情况下,与PKC抑制剂Calphostin C共孵育之后,经RT-PCR和Western Blot检测发现ACAT1表达明显降低。结论:成功构建pQCXIP-HA-Adi逆转录病毒载体,并获得稳定高表达adipophilin蛋白的RAW264.7细胞株。高表达adipophilin可明显上调RAW264.7细胞ACAT1的表达。Adipophilin通过ACAT1促进细胞内脂质蓄积的过程中,可能有PKC的参与。