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复苏植物是一类能耐严重干旱胁迫,在失去自身95%的水分后仍能维持细胞活力并在复水后快速恢复生理功能的植物的统称。对其耐旱机制的研究意义重大。复苏植物在低等植物和高等植物中的复苏能力与机理不同,低等植物一般是组成型耐旱,而高等植物中一般是诱导获得型耐旱。高等复苏植物耐旱机理的研究是研究复苏植物的热点。 牛耳草(Boea hygrometrica)是中国东部、南部和西南部广泛分布的一种复苏植物。随着2015年该植物基因组草图测序完成,牛耳草成为研究复苏植物的一种模式植物。但由于该植物基因组比较大,生长周期比较长,且遗传转化体系还不成熟,所以用正向遗传学方法来进行研究难度比较大。 超大片段转化技术可以将50-100kb长的DNA片段转入植物基因组中,对研究多基因控制或者基因簇的功能有优势。利用超大片段转化技术将牛耳草基因组片段转入拟南芥中,观察转基因植物抗渗透胁迫、耐碱的表型,发现四个可提高转基因植物对渗透胁迫、碱胁迫抗性的大片段。测序发现这四个片段都是逆转座子。对其中片段1-4具有相同表型的亚克隆S21转基因株系进行转录组和小RNA测序分析,发现其耐逆功能可能与小RNA功能相关。 加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression networkanalysis,WGCNA)利用系统生物学的思路寻找基因之间表达的相似性,并将表达高度相关的基因确定为一个基因模块。从而解决传统实验方法对于实验材料的限制,同时解决传统组学分析方法对于大样本量数据处理的局限,为复苏植物的研究提供了新思路。本论文还利用WGCNA的方法对牛耳草干旱复水的6个处理18个芯片表达量数据进行基因共表达网络分析。将得到的网络模块进行GO富集和KEGG富集分析,发现其中7个模块在光合、叶绿体、线粒体、内膜折叠等生物学过程和细胞器功能相关方面具有显著的富集效应,且模块中基因功能极为集中。对富集到的七7模块的Hub基因分析发现泛素化相关蛋白和转录因子蛋白在Hub基因组成中占比例较大。并通过Western blot实验验证了分析结果,说明泛素化蛋白确实在复水与脱水过程中有重要作用。牛耳草在慢速干旱脱水过程中通过抑制泛素化防止蛋白质的过分降解,可能有利于保障复水后功能蛋白的数量。 Comprehensive Microarray Polymer Profiling(CoMPP)是一种检测碳水代谢物成分的新技术,通过在芯片上固定能够与特定碳水化合物结合的特异性抗体,来检测生物中碳水代谢物成分和含量。本文利用CoMPP技术对不同处理牛耳草以及同科的非复苏植物烟叶唇柱苣苔(Chirita heterotricha)的细胞壁代谢成分进行分析,发现一些在复苏植物和非复苏植物中差异比较大的成分。将转录组芯片对应的八个牛耳草处理样本的CoMPP数据与转录组芯片数据进行关联分析,发现与LM2探针对应的糖蛋白含量高度正相关的基因也极度集中的富集在泛素化相关途径,而与其高度负相关的基因则富集到细胞壁方面,暗示泛素化在牛耳草复水与脱水过程中细胞壁功能维持方面有重要作用。 综上所述,大片段的结果表明逆转座子或者小RNA作用可能对牛耳草在喀斯特地貌碱性环境下生长具有重要贡献。WGCNA方法第一次被用于分析复苏植物脱水复水过程数据,对基因模块信息的进一步挖掘有助于更深入地研究关键基因、关键信号通路、基因之间的调控机制在复苏植物极度耐旱过程中的作用和意义。用CoMPP测得的牛耳草脱水复苏过程和烟叶唇柱苣苔细胞壁的成分和含量数据与转录组芯片数据进行联合分析,解析了复苏植物牛耳草细胞壁成分与同科非复苏植物的所对应的细胞壁的差异,同时也说明了泛素化过程在复苏植物脱水复苏过程中细胞壁功能维持方面的重要作用。