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实验目的:中重度的机械创伤(Mechanical trauma,MT)可以引起心肌细胞凋亡从而造成心脏功能降低,很多研究表明MT可以导致机体强烈的氧化应激反应和大量细胞炎性因子的释放。创伤血浆(Traumatic plasma,TP)中过多产生的肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α),是非致命性MT引起心肌细胞凋亡最主要的病理性介质,其中TNF-α由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)活化的单核—巨噬细胞产生,而LPS作为内毒素来自革兰氏阴性细菌的细胞壁,然而实验中SD大鼠遭遇的机械创伤是顿性的挫伤与摔伤,体表没有开放性创口,即没有外部感染。有文献显示汶川地震中发现有患者未遭遇贯穿性损伤,但有肠组织坏死及菌群移位的病例。由于肠道是体内最大的贮菌库和内毒素库,因此推测创伤导致的消化道黏膜屏障损伤是血液中LPS增高的主要原因。;实验目的第一步是寻找机械创伤后肠道出现损伤的位置和菌群移位证据,探究细菌如何转移到血液循环,第二步尝试用药物胰高血糖素样肽-2(Glucagonpolypeptide-2,GLP-2)对创伤SD大鼠进行干预,检测是否可以保护该状态下的盲肠黏膜层。实验方法:实验采用苏木精-伊红(Hematoxylin eosin,HE)染色法对创伤后SD大鼠(雄性)的盲肠组织标本进行染色、切片,并对机械创伤后不同时间点的大鼠盲肠的黏膜层进行观察,重点关注刷状缘、隐窝和黏膜层整体形态,并确定创伤后出现较明显损伤的最早时间点。使用透射电镜观察创伤后各个时间点盲肠标本,重点关注黏膜层表层的微绒毛与细胞连接的变化,确定损伤出现的最早时间点。使用(Elisa)试剂盒(用酶标仪在450nm波长段检测),对创伤后不同时间点SD大鼠血浆中LPS与D-乳酸两个细菌的标志物进行检测,探究其在创伤后血浆中随时间的变化趋势。为了治愈盲肠在创伤过程中所受创伤,进一步使用GLP-2对SD大鼠在创伤前进行药物干预,同样使用HE,透射电镜,Elisa对血浆中LPS和D-乳酸检测,确认GLP-2是否对该条件下盲肠具有明显的保护作用。在对GLP-2疗效确认后,进一步检测不同浓度GLP-2的保护效果,检测指标为D-乳酸。大鼠盲肠内部存在一定量内容物,在创伤过程中可能是造成盲肠黏膜层损伤原因甚至是主要原因。于是对大鼠进行不同时长的饥饿后,再进行机械创伤,对创伤后12h盲肠HE标本进行形态学观察,确定是内容物还是创伤本身造成的对黏膜层的损伤。实验结果:1.机械性创伤对消化道内损伤位置的定位1.1机械创伤(200转)会对SD大鼠盲肠造成明显的损伤HE染色结果显示,与空白对照和假创伤组相比,机械创伤后,在200转下,创伤后12h,24h,48h损伤明显。可以造成雄性SD大鼠盲肠黏膜层刷状缘不整齐,结构散乱,隐窝易出现变形,杯状细胞活跃。1.2机械创伤对SD大鼠的胃和回肠末端没有严重损伤HE染色结果显示,SD大鼠的胃黏膜表层,在创伤后6h有轻度空泡化出现,随着创伤后时间的延长,呈现逐渐自行愈合的趋势,与对照组(假创伤)相比,创伤后12h,24h,48h已无明显区别。SD大鼠回肠末端,在创伤后各时间点均无明显的损伤变化。与胃和回肠末端相比,盲肠损伤最明显。2.确定盲肠超微结构出现较明显损伤最早时间点:创伤后20min透射电镜下超微结构显示,与对照组(假创伤)相比,创伤后20min盲肠即出现黏膜层中微绒毛稀疏减少,细胞连接增宽,细胞结构一定程度疏松,并且有随着时间延长损伤逐渐加重的趋势。在创伤后各时间点的增宽的细胞连接中有自噬小体等出现,在创伤后12h显示有细菌样微生物出现在毛细血管附近。3.确定了机械创伤后不同时间点SD大鼠血浆中LPS的变化与对照组相比,机械创伤后SD大鼠血浆中的LPS在创伤后逐步上升,并且在创伤后20min达到最高点,与对照组相比有显著性差异;创伤后1Omin与创伤后20min相比有显著性差异,即在创伤后10min到20min出现了 LPS的急剧升高,之后LPS略有下降,但仍保持较高的水平,在创伤后48h出现明显降低。4.确定了机械创伤后不同时间点SD大鼠血浆中D-乳酸的变化与对照组相比,SD大鼠在机械创伤后血浆中的D-乳酸水平随创伤时间延长逐步上升,并且在创伤后20min达到最高点,与对照组相比有显著差异性,之后D-乳酸在血浆中维持较高水平,创伤后48h相对于创伤后24h出现明显的降低,具有显著性差异。5.GLP-2对机械创伤后SD大鼠的盲肠可以起到保护作用根据HE染色结果,透射电镜结果,GLP-2用药组与未做任何处理的SD大鼠在创伤后12h相比,用药组SD大鼠黏膜层更加完整,微绒毛相对整齐,细胞连接相对完好,形态上更加接近于正常组,同时也优于PBS(GLP-2溶剂)组,因此GLP-2对SD大鼠具有一定保护作用。GLP-2对创伤后SD大鼠血浆中LPS水平有降低作用GLP-2以10μg/100g/次注射再进行创伤,显示比PBS(GLP-2溶剂)注射组有显著性的降低血浆中LPS的作用,显示GLP-2而不是PBS在发挥保护盲肠屏障的作用。GLP-2对血浆中D-乳酸(Elisa法检测)水平的影响GLP-2以10μg/100g/次给药再进行创伤,与机械创伤组相比,D-乳酸明显下降,GLP-2皮下注射组与PBS皮下注射组相比,血浆中D-乳酸水平更低,只是未达到显著性要求。6.不同浓度的GLP-2对血浆中D-乳酸的降低作用GLP-2皮下注射剂量分为4组:2.5μg/1 00g/次,5μg/100g/次,10μg/100g/次,20μg/100g/次,数据显示GLP-2在20μg/100g/次浓度的的比其他浓度更能降低血浆中D-乳酸的浓度,具有更好的盲肠屏障保护效果。GLP-2对SD大鼠创伤后血浆中D-乳酸的浓度的降低效果,与GLP-2的浓度呈正相关关联。7.维生素K2(VK2)复合制剂可能具有一定程度的盲肠保护作用透射电镜结果显示,VK2灌喂组(灌喂3天后创伤)盲肠微绒毛更加完整,细胞连接有一定程度的恢复,对于机械创伤导致的SD大鼠肠黏膜,可能具有一定程度的保护作用。8.确定盲肠内食物残渣不是机械创伤造成盲肠的损伤的主要原因。经过不同时间段饥饿:饥饿24h,48h,72h,使盲肠内容物减少后再进行创伤,其结果显示饥饿后再进行创伤并未明显减轻黏膜层的损伤,甚至有一定程度的损伤加重,即机械性创伤是造成盲肠黏膜层损伤的主要原因,而非内容物。结论:以上研究结果表明机械创伤会对SD大鼠的盲肠造成明显的损伤,且在创伤后20min即造成微绒毛,细胞连接等超微结构的破坏,肠道细菌标志物LPS,D-乳酸进入血液循环,菌群移位出现。GLP-2可以对机械创伤后的盲肠黏膜起到保护作用,根据目前结果,GLP-2在25-200μg/ml次范围内,最佳浓度为200μg/ml。