原生质体融合选育纤维素发酵产脂菌株

来源 :福建师范大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:chenminer
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原生质体融合技术是通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合而达到杂交目的的基因重组技术。深黄被孢霉3.3410(Mortierella isabellina AS 3.3410)是油脂高产菌,但是不能直接利用纤维素,而黑曲霉SL2-111(Aspergillus niger SL2-111)有高纤维素酶活性,但是不能产生油脂。本实验通过原生质体融合技术筛选能直接利用纤维素原料的产油菌株。本研究的主要结果如下:(1)深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111的原生质体制备和再生的方法。深黄被孢霉3.3410原生质体制备和再生条件是:采用0.8 mol/L MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂,培养20h的菌丝体在浓度为1.2%溶菌酶+0.5%纤维素酶+0.8%蜗牛酶的混合酶液中酶解4h,酶解温度为30℃,PDA高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到6.3×107个/mL,再生率达到25.1%。黑曲霉SL2-111原生质体制备和再生的条件是:采用0.8 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,培养12h的菌丝体在浓度为1.0%溶菌酶+1.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶的混合酶液中酶解4h,酶解温度为30℃,PDA高渗再生培养基上进行再生培养。原生质体的浓度达到7.2×107个/mL,再生率达到28.6%。(2)深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111的原生质体灭活的方法。分别用紫外灭活和热灭活方式对深黄被孢霉3.3410和黑曲霉SL2-111原生质体进行灭活。结果,深黄被孢霉3.3410在15W紫外灯距离10cm处照射15min或者在55℃恒温水浴锅中加热15min;黑曲霉SL2-111在15W紫外灯距离10cm处照射15min或者在55℃恒温水浴锅中加热20min,两亲株原生质体的灭活率也达到100%。(3)原生质体融合的方法。使用45%的PEG作为助融剂,对经紫外灭活的深黄被孢霉3.3410原生质体和热灭活的黑曲霉SL2-111原生质体进行融合,融合温度为35℃,融合时间为10 min,融合率达到1.92%。对融合菌株进行挑选,获得了能直接利用纤维素原料的产油菌株。初步实现了选育目的。
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