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背景:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）是一种以肝细胞中脂肪过量堆积为特征的疾病,全球成年人NAFLD患病率为25%,中国近二十年的患病率为29.6%,同时它也是儿童和青少年最常见的疾病之一。NAFLD分为非酒精性单纯脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH）,后者约有10%-25%的患者会进展为肝纤维化,约20%的患者可进展为肝硬化或肝癌,预测到2025年NASH将取代丙肝成为需要肝移植的主要病因。但是目前FDA尚无批准用于NAFLD的治疗药物,临床主要通过改变不良生活方式如健康饮食,加强锻炼,减轻体重来干预疾病进展。所以NAFLD领域临床远未满足,寻找和开发治疗NAFLD的新药显得十分迫切。NAFLD的特点是由于肝脏摄取和自身合成的脂肪酸过多,脂肪酸在肝内以甘油三酯的形式发生堆积,肝脏发生脂肪变性,从而导致细胞损伤和功能障碍（脂毒性）以及引起一系列后续的炎症反应和纤维化形成,进而导致肝脏出现非酒精性脂肪性肝炎的组织学表型。乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-coenzyme A Carboxylase,ACC）是一种生物素依赖性羧化酶,可催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A,具有两种亚型ACC1和ACC2,二者分别参与脂肪酸从头合成和脂肪酸β氧化调节,抑制ACC可改善肝脏脂肪变性,降低脂毒性物质对肝脏的损伤,因此是潜在的治疗NAFLD的有效靶点。目前针对NAFLD适应症开发的ACC抑制剂GS0976和PF-05221304已进展至临床2期,二者均在临床前和临床上显示出显著的抗脂肪变性的作用。本课题以GS0976通用结构为基础,改构出一系列化合物进行以下研究。实验目的:通过稳定的体外筛选平台和动物模型,进行ACC抑制剂的临床前药效研究,筛选出体外活性及体内药效与阳性化合物（GS0976）相当或更优的ACC抑制剂。1.候选化合物体外实验初步筛选:实验方法:1)通过ACC1和ACC2酶活性实验,筛选出酶抑制活性较高的化合物;2)通过细胞实验,筛选酶抑制活性较高的化合物对脂肪从头合成（De novo lipogenesis,DNL）抑制能力较强的化合物;实验结果:1)通过ACC1和ACC2酶活性实验,共筛选22个化合物,其中11个化合物对ACC1和ACC2都具有较强抑制作用,分别为C1002、C1006、C1008、C1010、C1013、C1014、C1016、C1018、C1019、C1020和C1021,其IC50与阳性化合物GS0976相当;2)对ACC酶活性好的9个化合物进行细胞DNL测试,其中8个化合物（C1002、C1006、C1013、C1016、C1018、C1019、C1020、C1021）对细胞DNL的抑制优于阳性化合物,IC50分别为54.3、10.9、7.1、64.4、30.5、4.6、3.8和5.6n M;2.候选化合物体内活性筛选:实验方法:根据第二章实验筛选结果,选取3个化合物C1016、C1018和C1019,通过高脂饮食诱导C57BL/6小鼠脂肪肝模型考察其对脂肪变性的作用;实验结果:脂肪肝模型小鼠中,GS0976、C1016、C1018和C1019在30mg/kg均可降低肝脏TG含量,降低率分别为58.54%、61.17%、51.40%和32.67%,其中C1016改善脂肪变性的作用与GS0976相当。3.体内NASH模型药效学研究:实验方法:根据以上实验筛选出最优候选化合物C1016,采用以下实验进行考察:1)西方饮食诱导ob/ob小鼠NASH模型和2)胆碱缺乏-含0.1%蛋氨酸的高脂饮食（Choline deficient diet with 0.1%Methionine,CDAHF）饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型考察C1016的药效;另外采用3)四氯化碳诱导的肝纤维化模型考察化合物对肝纤维化的影响;实验结果:1)西方饮食诱导ob/ob小鼠NASH模型中,C1016 10和30mg/kg对肝组织病理学脂肪变性、炎症和气球样变评分无明显影响,但可将肝脏甘油三酯（Triglyceride,TG）水平分别降低33.79%和42.13%（149.65±24.27和130.80±11.97 vs模型对照226.02±27.26 mg/g,P<0.001）,胆固醇（Cholesterol,CHO）水平分别降低38.65%和37.93%（24.09±7.89和24.37±4.40 vs模型对照39.26±4.35 mg/g,P<0.001）;另外可剂量依赖性降低血清谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT,P<0.05）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST,P<0.05）水平;2)CDAHF诱导C57BL/6小鼠NASH模型中,C1016 10mg/kg可显著降低肝脏TG含量达35%（136.94±32.07 vs模型对照210.51±28.20 mg/g,P<0.001）以及降低肝脏CHO含量达19.03%（3.02±0.64 vs模型对照3.73±0.67 mg/g,P<0.05）,同时可降低血清ALT（P<0.05）和AST（P<0.05）水平,对肝脂质含量的改善强于GS0976,肝功能的改善作用弱于GS0976,两个化合物均对肝组织病理的脂变和炎症评分,以及纤维化面积无明显改善作用;3)CCL4诱导的肝纤维化模型中,C1016 30mg/kg给药4周可显著降低血清ALT（P<0.001）、AST（P<0.001）和总胆红素（Total bilirubin,TBil）（P<0.001）水平,组织病理上,其可显著降低46.73%肝纤维化面积（1.24±0.31 vs模型对照1.74±0.10%,P<0.001）以及肝细胞坏死评分（0.25±0.46,P<0.001）,在该模型中,C1016对各指标的作用均优于阳性化合物GS0976。实验结论:经过体外酶活性实验、细胞DNL实验以及体内脂肪肝模型、NASH模型的药效评价,筛选出ACC1和ACC2双靶点抑制剂C1016。C1016在体内外模型中均体现出良好的抑制DNL和降低肝脏TG、CHO含量的作用,另外C1016对化学毒性物质诱导的肝纤维化模型具有较强的抗纤维化作用。