基于多组学研究氨气、苯甲醛对寡孢节丛孢抑菌作用机制

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本研究以寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)为研究对象,采用土壤中代表性的抑制性化合物氨气与苯甲醛,收集两种化合物处理、未处理、萌发24 h的孢子样品,组成关联样本,利用非标记定量蛋白质组学(Label-free)技术测定孢子的泛素化修饰蛋白组。以超过2倍和小于0.5倍,筛选泛素化表达上调和下调的蛋白,结果发现在氨气和苯甲醛的抑菌作用下,有数百个赖氨酸位点的泛素化修饰水平上调了至少2倍,表达模式聚类分析结果也表明氨气、苯甲醛的抑菌作用显著改变了孢子蛋白的泛素化修饰水平。我们还对这些泛素修饰差异蛋白进行了COG功能分类、KEGG代谢途径富集分析、蛋白相互作用分析以及泛素修饰位点的motif分析。我们还把项目组之前测定同样条件下的孢子蛋白质组和转录组的数据与泛素化修饰组数据进行了关联分析。分析发现,不管是在氨气抑菌条件下,还是苯甲醛抑菌条件下,只有少量下调蛋白的泛素化修饰水平上升,少量下调蛋白的基因转录水平降低,绝大部分下调蛋白的泛素化修饰水平没有升高,基因转录水平没有降低。这些结果提示在氨气、苯甲醛抑菌条件下,大量蛋白质表达水平下调与泛素化水平升高和基因转录水平降低无关。氨气、苯甲醛抑菌条件下泛素化修饰水平升高和基因转录水平降低不是蛋白质表达水平下降的主要原因。我们从组学数据中挑选了部分差异蛋白,利用同源重组的方法对这几个蛋白的编码基因(AOLs00076g167,AOLs00007g395,AOLs00215g687,AOLs00076g699,AOLs00112g95,AOLs00004g254,AOLs00078g131,AOLs00004g335)进行敲除。最后对敲除株菌丝的生长形态、生长速率与抗逆性,产孢量与孢子在胁迫环境中的萌发率等进行研究,部分菌株在这些表型方面与野生型有显著差异。(1)AOLs00076g699基因编码蛋白MAPK激酶MKK2/SSP33,该基因的敲除株不产孢,菌丝生长形态、速度、密度较野生型有显著差异,在PDA、TG、TYGA三种基本培养基的生长速率较野生型慢了60.78%、83.24%、80.35%。(2)AOLs00004g335基因编码的蛋白是乳酰谷胱甘肽裂解酶,是细胞体内甲基乙二醛的解毒酶。在氨气和苯甲醛抑菌条件下该酶的表达水平上调。在苯甲醛和甲基乙二醛的抑菌作用下,该基因敲除株孢子的萌发率较野生型显著降低,敲除株孢子抵抗苯甲醛与甲基乙二醛抑制作用的能力被极大的削弱了。(3)葡萄糖能够显著解除氨气对孢子萌发的抑制;对于苯甲醛的抑菌作用,低浓度葡萄糖能显著解除其对孢子萌发的抑制,高浓度的葡萄糖则加强了苯甲醛对孢子萌发的抑制。敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因AOL s00078g131之后,在氨水抑制下的孢子萌发率与野生型相比没有差异,在苯甲醛抑制下的孢子萌发率显著降低。葡萄糖依然能够解除氨水对敲除株孢子萌发的抑制,这些结果显示葡萄糖ED代谢途径对于寡孢节丛孢孢子抵抗苯甲醛的抑菌作用具有非常重要的意义。本研究发现氨气、苯甲醛的抑菌作用导致了数百个赖氨酸位点的泛素化修饰水平显著上升。结合转录组学、蛋白组组学和泛素修饰组学的数据分析发现,在这两种化合物的抑菌作用下,数百个蛋白的表达水平显著降低。这些下调蛋白中,少量下调蛋白的泛素化修饰水平上升,少部分下调蛋白的基因转录水平降低,绝大部分下调蛋白的泛素化修饰水平没有升高,基因转录水平也没有降低。这些结果表明氨气、苯甲醛抑菌条件下泛素修饰水平升高和基因转录水平降低不是蛋白质表达水平下降的主要原因。我们从组学数据中筛选了几个重要的蛋白质,敲除了这些蛋白质的编码基因,对突变株一系列的表型检测结果显示基因AOLs00076g699,AOLs00004g335和AOLs00078g131在氨气和苯甲醛抑菌作用中发挥着重要作用。
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