研究背景与目的：　　 在消化系统肿瘤中,食管癌是常见恶性肿瘤之一,对人类的健康和生命造成了极大的威胁。其具有发病率高及发病隐匿、转移和死亡率高等特点。目前临床上用于食管癌治疗的方法主要是外科手术治疗、化疗、放疗以及综合治疗,尽管近年来各种治疗方法得以不断改进和完善,但食管癌患者的预后仍然较差,为提高食管癌的疗效和改善患者的生存质量,寻求一种新的治疗方法是当前食管癌治疗的研究热点。　　 Smoothened(Smo)基因是由3772bp构成的DNA序列,基因定位于染色体7q32.3。Smo蛋白是由Smo基因编码的一条具有1024个氨基酸残基组成的蛋白质。Smo蛋白在Hedgehog(Hh),信号通路中充当着信号转换器的作用,它可以将来自细胞外的Hh信号转换为细胞内可识别的特异性转录因子Gli1信号,进而作用于下游靶基因Ptch、Wnt、Bmps等。当细胞间质中有Hh配体存在时,Smo蛋白摆脱了Ptch受体的束缚,此时的Smo蛋白将向微管复合体上Fu和Cos2提供磷酸基团促使Glil从复合体上脱离,此时的Gli蛋白转化成催化剂形式并以全长的形式进入细胞核启动下游基因转录。　　 Gli1基因定位于染色体12q13.2-q13.3,其与Gli2、Gli3均有5个保守的锌指结构,锌指间由组氨酸与半胱氨酸连接。Gli1基因编码的产物Gli1蛋白是特异性转录因子,可将胞质内信号传递到细胞核,启动下游基因的转录,Gli基因家族与果蝇Ci基因是同源基因,它们编码的蛋白质在Hh信号通路中起到关键作用。　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)指双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)在胞质中Dicer酶(一种核酶)的作用下,以一种ATP依赖的方式逐步将外来的双链RNA(dsRNA)切割成特定长度的小干扰RNA(siRNA),长度一般为21nt-23nt,siRNA再与体内的内切酶、外切酶和解旋酶等共同组成可被RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),然后RISC激活ATP酶依赖的siRNA解双链过程。外源性、内源性基因编码的mRNA与激活后的RISC在同源区域特异性的结合,在RISC的核酸酶功能的作用下,对其mRNA与siRNA中反义链互补结合部的3端和5端切割,切割位点间的mRNA迅速被降解。　　 现已证实Smo基因的高表达与多种肿瘤的发生有关,如:胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和基底细胞癌等。近期本实验室相关研究结果显示,Smo、Gli蛋白及mRNA在食管鳞癌细胞中高表达;Smo高表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关;Smo siRNA可抑制食管鳞癌的浸润和转移。可见Smo与食管癌的发生发展有关。　　 本研究采用不同浓度Smo siRNA转染食管癌EC9706细胞,筛选出对Smo表达抑制效应最强的Smo siRNA序列、浓度和作用时间后,构建裸鼠食管癌移植瘤模型,即将浓度为250ng/μl的Smo siRNA-1转染食管癌细胞72h后收集细胞,调节浓度为1×107/ml,以裸小鼠背部肩胛旁区作为注射点,分别皮下注射0.2ml。采用免疫组织化学及Western blot技术检测各组瘤组织中Smo及Gli1蛋白的表达;采用组织原位杂交及RT-PCR技术检测各组瘤组织中Smo及Gli1 mRNA的表达;采用TUNEL法检测细胞凋亡情况,采用透射电镜对凋亡细胞的超微结构进行观察,为分子靶向治疗食管癌提供实验基础和理论依据。　　 材料和方法：　　 1.人食管癌EC9706细胞株来自于中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室惠赠;Balb/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。　　 2.分组转染:设24h、48h和72h三个转染时间段,每个时间段均设150ng/μl、200ng/μl和250ng/μl三个转染剂量,将特异性siRNA-1、siRAN-2及siRAN-3分别转染EC9706细胞,结果显示250ng/μl、siRNA-1和72h组抑制效应最强,并将此组细胞构建为裸鼠食管癌移植瘤实验组。　　 3.裸鼠食管癌移植瘤模型构建:将裸鼠分为3组,每组5只分别为:siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组,以肩胛下为注射点,分组皮下注射各组细胞,构建裸鼠食管癌移植瘤模型。　　 4.采用免疫组织化学及Western blot方法检测各组瘤组织Smo及Gli1蛋白的表达情况。　　 5.采用组织原位杂交及RT-PCR技术检测各组瘤组织Smo及Gli1 mRNA的表达情况。　　 6.采用TUNEL法对各组瘤组织的凋亡状况进行检测。　　 7.采用透射电镜技术对裸鼠食管癌移植瘤细胞超微结果进行观察。　　 8.统计学处理:应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,资料用均数士标准差(X±S)表示;两组均数的比较用t检验;多组均数的比较用方差分析;方差不齐时先进行变量转换。显著性水准α=0.05。　　 结果：　　 1.Smo siRNA对裸鼠成瘤体积的影响　　 15只裸鼠皮下移植瘤明显,3组裸鼠成瘤率均为100％。连续4w测量3组裸鼠的成瘤体积,可见siRNA干扰组瘤体最小,裸鼠瘤体体积明显小于空白对照组和无关序列组。经过4w饲养,裸鼠处死后迅速测量体积,结果分别为:2563.28±73.69、2405.62±67.45和873.57±19.87,实验组与对照组两两相比裸鼠移植瘤体积差异具有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 2.各组裸鼠移植瘤体生长曲线　　 分别在接种1、2、3、4w进行裸鼠瘤体体积测量,然后绘制其生长曲线。结果显示:siRNA干扰组裸鼠瘤体生长缓慢且瘤体体积显著小于空白对照组及无关序列组,组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3细胞形态学改变　　 经HE染色后,各组裸鼠食管癌移植瘤组织在光镜下可见大小不等形态不一的瘤细胞团,其间可见散在的小片状或灶状坏死,在裸鼠移植瘤的瘤细胞团内可见到由少量纤维结缔组织成分构成的间质。裸鼠食管癌移植瘤细胞大小不等、多呈圆形、细胞核深染、核仁可见,异型性明显,病理性核分裂像可见。　　 4.免疫组织化学结果　　 4.1各组瘤组织中Smo蛋白的表达情况　　 免疫组织化学结果显示,Smo蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒,阳性信号主要定位在细胞的胞质内,实验组与各对照组相比胞质中棕黄色颗粒明显减少。在siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组瘤组织中Smo蛋白表达量分别为2.63±0.57、8.42±1.49和8.37±1.73,实验组与对照组两两对比,差异具有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组对比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 4.2各组瘤组织中Gli1蛋白的表达情况　　 免疫组织化学结果显示,Gli1蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒,阳性信号主要定位在细胞核内,细胞质次之,实验组与各对照组相比胞核及胞质内棕黄色颗粒明显减少。在siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组瘤组织中Gli1蛋白表达量分别为2.32±0.63、7.37±1.57和7.29±1.49,实验组与对照组两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 5.Western blot法检测各组裸鼠移植瘤组织中蛋白的表达　　 5.1各组瘤组织Smo蛋白的表达情况　　 Western blot显示,空白对照组、无关序列组和siRNA干扰组瘤组织中Smo蛋白相对表达量分别为:0.91±0.05、0.89±0.06和0.33±0.06,实验组与对照组两两对比差异有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 5.2各组瘤组织中Gli1蛋白的表达情况　　 Western blot显示,空白对照组、无关序列组和siRNA干扰组瘤组织中Smo蛋白相对表达量分别为:0.84±0.06、0.87±0.08和0.29±0.05,实验组与对照组两两相比差异有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 6.组织原位杂交检测结果　　 6.1各组瘤组织中Smo mRNA的表达情况　　 裸鼠移植瘤组织原位杂交结果显示,各组瘤组织中Smo mRNA主要定位于细胞质,阳性染色呈紫蓝色颗粒,实验组与各对照组相比胞质中紫蓝色颗粒明显减少。siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组瘤组织中的Smo mRNA表达量分别为:3.53±0.37、9.61±0.85和9.82±0.63,Smo mRNA表达量在三组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05),空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 6.2各组瘤组织中Gli1 mRNA的表达情况　　 裸鼠移植瘤组织原位杂交结果显示,各组瘤组织中Gli1 mRNA主要定位于细胞质,阳性染色呈紫蓝色颗粒,实验组与各对照组相比胞质中紫蓝色颗粒明显减少。siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组瘤组织中的Gli1 mRNA表达量分别为:3.35±0.87、8.41±1.64和8.53±1.38,三组间两两相比Gli1 mRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.05),空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 7.RT-PCR检测结果　　 7.1各组瘤组织中Smo mRNA的表达情况　　 Smo mRNA经RT-PCR扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行扩增结果的检测,逆转录后的smo mRNA扩增产物与实验设计一致,扩增片段为306bp,作为对照的β-actin内参为480 bp。扩增后经琼脂糖凝胶电泳后,siRAN干扰组、无关序列组和空白对照组灰度值分别为:0.35±0.07、0.98±0.06和0.96±0.07,si RNA干扰组smo mRNA的表达量降低,实验组与对照组两两对比差异有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 7.2各组瘤组织中Gli1 mRNA的表达情况　　 Gli1 mRNA经RT-PCR扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行扩增结果的检测,逆转录后的Gli1 mRNA扩增产物与实验设计一致,扩增片段为201bp,作为对照的β-actin内参为480 bp。扩增后经琼脂糖凝胶电泳后,siRAN干扰组、无关序列组和空白对照组灰度值分别为:0.29±0.05、0.89±0.07和0.87±0.06,siRNA干扰组Gli1 mRNA的表达量降低,实验组与对照组两两对比差异具有统计学意义(P＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 8.TUNEL检测各组细胞凋亡的情况　　 在凋亡的检测中,siRNA干扰组较各对照组凋亡率增加,TLINEL检测结果在siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组分别为:18.93±1.52、3.73±0.41、3.58±0.37。实验组与各对照组组间凋亡率差异均有统计学意义(P均＜0.05);空白对照组与无关序列组相比,凋亡率差异均无统计学意义(P均＞0.05)。　　 9.透射电镜观察各组细胞凋亡的情况　　 透射电镜下siRNA干扰组细胞微绒毛减少、胞质固缩、细胞体积变小、电子致密度增高,可见凋亡早期细胞,染色质固缩并凝结成形态不同的块状聚集于核内不同部位;内质网疏松化并与胞膜融合形成一个个空泡;凋亡晚期细胞可见,细胞核裂解为碎块状,产生数量不等体积不同的凋亡小体。两对照组细胞膜完整,线粒体等细胞器正常,细胞核正常,与实验组相比,实验组凋亡细胞数明显增加。　　 结论：　　 1.Smo siRAN可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Smo mRAN、Smo蛋白的表达,同时可下调Gli1 mRNA、Gli1蛋白的表达。　　 2.Smo siRNA可体内诱导裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡。