心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤是指心肌缺血后一种很常见的病理生理过程,指急性缺血的心肌在恢复血流再通后,功能代谢及细胞结构矛盾地出现进一步加重的现象。经多年研究发现,心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,I/R)是一个多种因素、多种机制相互作用、相互促进、相互发展的级联反应,其中主要的病理生理机制包括：自由基损伤(oxygen free radical injury)、细胞凋亡(apoptosis)和细胞内或线粒体内钙超载(calcium overload)、氧化应激反应(oxidative stress response)等等。除此之外,心肌缺血再灌注损伤还与炎性反应、胰岛素抵抗及血管内皮功能不调等其他因素有关。临床上,随着医疗技术的进步,早期及时溶栓治疗、急诊经皮冠状动脉腔内血管成形术已成为急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)血管再通的主要治疗手段,可以显著降低死亡率,改善病人的预后,但无再流现象或慢再流现象加重心肌损伤亦越来越引起学者们的重视。目前,心肌缺血再灌注损伤的治疗及预防措施主要包括技术和药物两个方面。缺血预适应(ischemia preconditioning, IPC)以及缺血后适应(ischemia postconditioning, IPO)是两种目前研究比较火热的减少心肌缺血再灌注损伤的措施,两者的不同之处在于处理的时程。近期研究发现,冠脉造影梗死心肌已无血管机械性阻塞证据的患者中,有超过25%的患者心肌组织水平的血流并没有恢复,或血流很慢,这就是无再流现象(no-reflow phenomenon)或慢再流现象(slow-reflow phenomenon)。1974年,Kloner等首先证实无再流现象与慢再流现象可发生于严重的、急性的、长时间的心肌缺血。其后的系列研究表明无再流现象或者慢再流现象可发生于有效溶栓治疗及急诊经皮冠状动脉介入治疗术(primary percutaneous coronary intervention, pPCI)术后,且急诊经皮冠状动脉介入治疗比择期治疗此现象的发生率要高得多,并且是造成不良预后的重要因素。目前无再流现象或慢再流现象是指急性心肌梗死冠脉血供恢复以后,心肌组织的再灌注出现了不完全、甚至出现无继续再灌注,它的具体机制尚不完全清楚,需要我们进一步研究,可是造成的结局却是因微循环的功能障碍或结构损伤所致的微血管血流不畅。其导致的恶性后果是心肌彻底坏死,梗死范围扩大,心室扩张和重构,心功能低下和心力衰竭,及恶性心律失常等严重并发症的发生率增高,住院病死率增加5-10倍。同时,研究发现急性心肌梗死患者的血浆中内皮素-1水平升高,可以加剧冠脉痉挛,从而加重无再流现象或慢再流现象,而且在心肌梗死的动物实验中发现再灌注后的心肌组织ET-1mRNA表达明显上调,并且与损伤程度相关。而内皮素-1引起冠状动脉平滑肌的收缩,必须依赖细胞外钙的内流。ET-1引起细胞内游离钙浓度上升,钙的来源来自于细胞内和细胞外,在无钙细胞外液的情况下,ET-1仍能引起细胞内游离钙浓度上升,即使在充分螯合细胞内钙的情况下兴奋ETA受体后,仍能激活PKC,故细胞保护作用与钙的变化无关,但ET-1引起血管平滑肌收缩,必须依赖细胞外的钙的内流。因此缩血管作用和细胞保护作用机制不同,理论上可以做到保留细胞保护作用而阻断缩血管作用。有前期研究表明低浓度的内皮素-1(<0.1nmol/L)引起的平滑肌收缩能够被钙离子拮抗剂LOE908或者SK&F96365所阻断,而高浓度的内皮素-1(>1nmol/L)引起的平滑收缩能被LOE908与SK&F96365各自分别减弱,但是却不能完全被各自阻断,其中LOE908的减弱效果很弱(约减弱10%),而SK&F96365的减弱效果较强(约减弱45%)。这可能是LOE908和SK&F96365对不同钙通道的敏感性不同造成的,配体门控钙通道1型(nonselective cation channel type 1, NSCC-1)对钙通道阻滞剂SK&F96365不敏感但对LOE908非常敏感的,配体门控钙通道2型(nonselective cation channel type 2,NSCC-2)对钙通道阻滞剂LOE908以及SK&F96365均很敏感的,而钙池控制的钙通道(store-operated calcium channel,SOCC)对SK&F96365敏感的却对LOE908不敏感,所以用SK&F96365阻断高浓度的内皮素-1所产生的强烈收缩血管作用,而保留低浓度的内皮素-1维持正常血管张力作用,从而减轻无再流现象或慢再流现象造成的心肌损伤具有理论可行性,而LOE908因阻断的效应弱(减弱10%)而达不到此效果。基于以上的理论基础,我们采用雄性新西兰家兔在体的心脏缺血再灌注模型,观察内皮素-1随再灌注时间长短的变化,同时观察两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365与LOE908不同时间点对心肌缺血再灌注损伤保护效果,并比较两者心肌缺血再灌注损伤的保护效果差别。钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对心肌缺血再灌注损伤的心肌保护效果目的我们的研究通过建立新西兰家兔活体的心脏缺血再灌注模型,并在此模型的基础上研究两种不同的钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对于内皮素-1的影响以及对心脏的保护作用。材料与方法1.实验动物本研究选用成年健康体重为2.0-2.5千克的雄性新西兰家兔；购于南方医科·大学实验动物中心。实验动物的使用及处理措施,严格按照广东省医学科学院的动物实验伦理委员会的要求方案进行,且尽可能减少动物的使用数量。2.动物在体缺血再灌模型的制备及分组将新西兰家兔随机分为四组(每组6只)：(1)假性手术组；(2)缺血再灌注(I/R)组：(3)SK&F96365处理组；(4)LOE908处理组。用兔子固定器固定好兔子后,从新西兰家兔耳缘静脉注入戊巴比妥钠(30毫克／公斤体重)进行麻醉,解剖暴露右颈内静脉,建立右颈内静脉静脉通路,供给药物及采血,且新西兰家兔经由气管T型切开气管内插管进行呼吸机辅助呼吸(35 cycles/分钟,tidal volume 10 mL air/千克)。采用左侧第3/4肋间开胸术小心地暴露心脏,心脏适应10分钟后,对左侧冠状动脉前降支进行结扎造成缺血,然后松开结扎恢复血流灌注。其中假性手术组中的新西兰家兔开胸后心脏适应10分钟以后,用4-0丝线仅仅是穿过左冠脉前降支的上1/3处,并没有缝扎30分钟,然后去掉丝线,于去掉丝线后30分钟,60分钟,120分钟检测内皮素-1、乳酸盐脱氢酶以及肌酸激酶同工酶(LDH、CK-MB)这三项指标,总时间160分钟。缺血再灌注(I/R)组开学后心脏适应10分钟以后,4-0丝线缝扎左冠脉前降支的上1/3处30分钟,然后松开丝线恢复再灌注,于松开丝线后30分钟,60分钟,120分钟检测内皮素-1、乳酸盐脱氢酶以及肌酸激酶同工酶(LDH、CK-MB)这三项指标,总时间160分钟。SK&F96365处理组,在I/R组的基础上,在恢复灌注时从颈内静脉静脉注射0.1mg/千克SK&F96365,于松开了丝线后30分钟,60分钟,120分钟检测内皮素-1、乳酸盐脱氢酶以及肌酸激酶同工酶(LDH、CK-MB)这三项指标,总时间160分钟。LOE908处理组在心肌缺血再灌注组的基础上,在恢复灌注时从颈内静脉静脉注射0.1mg/千克LOE908,于松开丝线后30分钟,60分钟,120分钟检测内皮素-1、乳酸盐脱氢酶以及肌酸激酶同工酶(LDH、 CK-MB)这三项指标,总时间160分钟。3.各项指标的观察于松开结扎冠脉丝线之后30分钟,60分钟,120分钟,抽取新西兰家兔颈内静脉血,检测内皮素-1(内皮素-1)、乳酸脱氢酶(LDH)以及肌酸激酶同工酶(CK-MB)这三项指标,实验结束后,对再灌注结束新西兰家兔心脏,进行TTC染色及切片测定新西兰家兔心肌梗死面积。4.统计学方法采用SPSS 19.0软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差表示,组间均数比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐则采用LSD方法,不齐则采用Dunnett-T3方法。当P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对心肌组织酶学指标的影响新西兰家兔心脏缺血再灌注30分钟后,缺血再灌注组中血浆乳酸盐脱氢酶LDH水平(1961.5±59.94 U/L)和肌酸激酶同工酶CK-MB水平(1069.5±48.62U/L)与假手术组血浆乳酸盐脱氢酶LDH水平(780.5±13.05 U/L)和肌酸激酶同工酶CK-MB水平(499.83±71.26 U/L)相比均显著性的增高(分别P=0.000与P=0.000),表明模型在一定意义上比较成功。分别运用两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908后,与缺血再灌注组比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1458.33±65.53 U/L和1468.83±36.30 U/L)和肌酸激酶同工酶CK-MB水平(724.83±22.60 U/L和732.67±11.20 U/L)均有明显降低(P=0.000和P--0.000)；但SK&F96365组和LOE908组两组间相互比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1458.33±65.53 U/L和1468.83±36.30 U/L)与肌酸激酶同工酶CK-MB水平(724.83±22.60 U/L和732.67±11.20 U/L)之间的差异没有统计学意义(分别P=0.71和P=0.77)。新西兰家兔心脏缺血再灌注60分钟,分别运用两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908后,与缺血再灌注组比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1535.83±68.99 U/L和1486.33±41.05 U/L)和肌酸激酶同工酶CK-MB水平(1151.17±55.62U/L和1166.67±49.06 U/L)均有明显降低(P=0.000和P=0.000)；但SK&F96365组和LOE908组两组间相互比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1535.83±68.99 U/L和1486.33±41.05 U/L)与肌酸激酶同工酶CK-MB水平(1151.17±55.62U/L和1166.67±49.06 U/L)之间的差异仍没有统计学意义(分别P=0.13和P=0.54)新西兰家兔心脏缺血再灌注120分钟,分别运用两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908后,与缺血再灌注组比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1594.83±41.18 U/L和1871.33±30.61 U/L)和肌酸激酶同工酶CK-MB水平(1472.33±137.24 U/L和1732.17±38.18 U/L)均有明显降低(P=0.000和P=0.000)；但SK&F96365组和LOE908组两组间相互比较,血浆中乳酸盐脱氢酶LDH水平(1594.83±41.18 U/L和1871.33±30.61 U/L)与肌酸激酶同工酶CK-MB水平(1472.33±137.24 U/L和1732.17±38.18 U/L)之间有差异并且有统计学意义(分别P=0.000和P=0.000)2.四组中血浆中内皮素-1浓度的变化新西兰家兔心脏缺血再灌注30分钟后,与假手术组(425.15±9.22 pg/ml)相比,其余三组内皮素-1的含量均有着显著增高(P值均为P=0.000)。持续再灌注60分钟,与假手术组(424.63±5.46 pg/ml),其余三组内皮素-1的含量亦有明显增高并有统计学意义(P值均为P=0.000)。持续再灌注120分钟,假手术组(426.33±6.40 pg/ml),其余三组内皮素-1的含量亦有明显增高并有统计学意义(P值均为P=0.000)3.新西兰家兔心肌梗死面积的变化与假手术组相比,新西兰家兔心脏缺血再灌注的措施增加了心肌的梗死面积(63.55±3.53%),有统计学意义(P=0.000)。分别运用两种不同钙离子拮抗剂SK&F96365(33.02±3.24%)和LOE908(43.58±1.49%)之后,与缺血再灌注组(63.55±3.53%)相比,梗死面积均有着显著降低(分别P=0.000与P=0.000)。且SK&F96365组和LOE908组两组之间相互比较,SK&F96365组的心肌梗死面积少于LOE908组,这种差异有统计学意义(P=0.000),这和心肌酶学指标的结果大致是一样的。全文结论1.新西兰家兔心肌缺血再灌注后,血浆中内皮素1的含量显著上升。2.两种不同的钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对于心肌缺血再灌注损伤具有心肌保护作用。3.SK&F96365和LOE908的心肌保护作用在再灌注30分钟及60分钟时间内保护效果并没有差别,在再灌注120分钟时,SK&F96365心肌保护效果优于LOE908。SK&F96365和LOE908对心肌缺血再灌注损伤产生的保护作用相关机制仍不清楚,可能与阻滞特定的钙通道有关,需要更深入的研究。